静电纺丝食品级天然高分子研究进展

邓伶俐 李 阳 张 辉*

（1 湖北民族大学生物科学与技术学院 生物资源保护与利用湖北省重点实验室超轻弹性体材料绿色制造国家民委重点实验室 湖北恩施445000 2 浙江大学生物系统工程与食品科学学院 浙江省农产品加工技术研究重点实验室浙江省食品加工技术与装备工程中心 杭州310058）

1 静电纺丝技术

静电纺丝技术是指聚合物熔体或者溶液在高压静电场作用下形成纤维的过程。与电喷技术形成的是单分散微米或者纳米聚合物球不同，静电纺丝技术是使带有电荷的高分子熔体或者溶液在高压静电场中喷射、拉伸、劈裂、固化或者溶剂挥发，最终形成纤维状物质的过程。早在1882年，Rayleigh[1]在研究带电液体微滴产生的不稳定问题时就指出当静电力克服表面张力时即可产生液体射流。直至1934年Formhals Anton 申请专利-一种人造纱的生产工艺及装置[2]。直到1990年左右纳米科技的兴起才让大家关注静电纺丝在工业上的应用。电纺得到的纤维尺度通常在几十纳米到几微米之间[3]，纳米级纤维能够赋予其所制备材料很多特殊的性质。

静电纺丝成形所用时间极短，整个过程原理涉及多交叉学科，包括流变学、流体力学、空气动力学、静电学等。常规纺丝装置如图1和图2所示，纺丝溶液被放入注射器中，金属电极连接溶液或者金属喷头，接受装置直接接地或者接通与金属电极相反的电极。喷头处的液滴在无电场的情况下受重力和表面张力平衡，随着电场的施加，液滴还收到电场力的作用形成锥体。随着电场强度的增加，锥体上的电荷密度增加，锥体角度增加。当超过临界电压时，表面张力与电场力的平衡被打破，此时产生锥形及泰勒锥（Taylor cone），泰勒锥处带电液滴喷射成纤维束，沿电场力的方向被拉伸，其间伴随着纤维束的劈裂细化和弯曲移动。在纤维束的喷射过程中，溶剂挥发和熔体冷却使纤维束逐渐固化，沉积于收集板上。

2 静电纺丝蛋白

2.1 胶原蛋白

胶原蛋白主要分布于动物的皮肤、骨、腱等连接组织中，是构成动物体最广泛的蛋白质。胶原蛋白具有优良的生物相容性和可降解性，对大部分细胞的粘附力强，在体内可由胶原酶的水解使其发生降解，在组织工程支架和伤口包覆方面具有广泛的应用。胶原蛋白在水中不溶，其电纺溶剂选择多集中在有机溶剂，如四氢呋喃[4-5]。Buttafoco等[6]首次尝试用10 mmol/L 盐酸作为溶剂，通过加入5wt% PEO 以及42.5 mmol/L 的NaCl 实现了胶原蛋白纳米纤维的制备。天然胶原蛋白需要有机溶剂或者添加盐来打破其氢键结构从而实现电纺，而变形后的胶原蛋白能够在乙酸溶液中成功电纺[7]。胶原蛋白单独电纺的溶剂具有局限性，而且单组分胶原蛋白纤维的机械性能较弱，研究中一般采用交联或者与其它高分子共纺的方式提高溶液的可纺性和纤维的综合性能。胶原蛋白已经实现了与弹性蛋白、壳聚糖、透明质酸钠、蚕丝蛋白、玉米醇溶蛋白等天然高分子的共纺[6，8-11]。通过与PCL、PEO、PLGA 等合成高分子进行共纺能够显著提高纤维的机械性能[12-14]。胶原蛋白纤维交联初期一般采用戊二醛熏蒸的方式，然而该方法得到的纤维会有戊二醛残留，具有一定的细胞毒性。Torres-Giner 等[15]比较了TG 酶交联、EDC 交联、京尼平交联以及紫外交联发现TG 酶交联的胶原蛋白纤维生物相容性最好（图3）。

图1 静电纺丝的基本原理示意图Fig.1 The schematic illustration of electrospinning setup

图2 喷射液滴的作用力剖析图Fig.2 Forces acting on the charged droplet during the electrospinning

图3 EDS/NHS（a）、京尼平（b）、TG 酶（c）交联后胶原蛋白对成骨细胞增殖性的影响Fig.3 Typical optical images of osteoblasts cultured in a cell medium during the first week （top） and last week （bottom） on collagen nanofibers cross-linked by （a） EDC/NHS （b） GP，and （c） TG

2.2 明胶

明胶是胶原蛋白经过酸法或碱法水解得到的一种衍生蛋白质，相对分子质量约为几千到10 万左右。虽然明胶是一种水溶性蛋白，但是由于其凝胶化性质很难在纯水溶液中电纺。早期电纺明胶选用三氟乙醇作为溶剂，在质量浓度0.05～0.15 g/mL 进行静电纺丝，能够得到形态良好的纳米纤维[16]。在研究过程中对溶剂毒性的考虑，Ki 等[17]采用甲酸作为明胶溶剂，在明胶质量浓度大于0.08 g/mL 后形成无串珠纤维，发现明胶甲酸溶液的黏度随着放置时间的延长而降低，说明明胶在甲酸溶液中会进行降解。由于明胶在低温条件下凝胶，Li 等[18]选用提高电纺温度的方式将明胶溶解在水溶液（V水∶V乙醇=9∶1）中，当明胶质量浓度达到0.15 g/mL，40 ℃时能够得到无串珠纤维，并且该体系中加入透明质酸能够提高电纺性。Song 等[19]发现明胶质量浓度在0.08～0.11 g/mL 之间，70%乙酸水溶液条件下可以成功电纺。近期明胶静电纺丝的研究多采用水/乙酸体系在常温下进行电纺，明胶质量浓度可以高达0.4 g/mL[20-21]，并且表面活性剂SDS 的添加能够显著增加明胶纤维的直径（图4）。由于电纺明胶纳米纤维膜在水溶剂体系中极易快速瓦解，所以一般采用交联的方式提高明胶电纺膜的水溶稳定性。至今为止大部分研究采用戊二醛熏蒸的方式进行交联[22-23]，也有研究者采用京平尼进行交联[24]。然而，化学交联剂的残留对于电纺膜在食品行业的应用有不利影响。Siimon 等[25]通过在明胶溶液中添加葡萄糖，通过美拉德反应进行交联，获得了水不溶电纺膜。Tavassoli-Kafrani等[26]采用氧化多酚的方式进行明胶纳米纤维的交联。为了提高明胶电纺膜的性能，研究者们将明胶和其它高分子进行共纺。Meng 等[27]将明胶和PLGA 进行共纺得到了强度和韧性均优于单一组分的电纺膜。

图4 明胶纳米纤维（a）以及添加1%（b），2%（c），3%（d），4%（e），5%（f） SDS 明胶纳米纤维形态及直径分布Fig.4 The SEM morphology and diameter distribution of gelatin nanofibers （a） and those added with 1% （b），2% （c），3% （d），4% （e），and 5% （f） SDS

2.3 玉米醇溶蛋白

玉米醇溶蛋白是一类能溶于乙醇溶液，提取于玉米中的蛋白质，富含谷氨酸和脯氨酸。由于玉米醇溶蛋白中含有大量的疏水性残基，其在水中溶解性差，由于其中还含有一些极性基团，如谷氨酰胺、天冬酰胺，因此玉米醇溶蛋白也不能溶解在无水乙醇中，易溶于乙醇水溶液中。静电纺丝玉米醇溶蛋白可以选用乙醇水溶液、甲醇水溶液、异丙醇水溶液以及乙酸水溶液等。通过乙醇水溶液电纺得到的玉米醇溶蛋白纳米纤维多呈缎带状，其形成的原因可能是溶剂挥发十分迅速，纤维瞬间形成了中空结构，随着纤维的拉伸中空结构坍塌即得到了缎带状的纤维。Selling 等[28]比较了不同溶剂对玉米醇溶蛋白纤维形态的影响，发现乙酸水溶液能够电纺出柱状的纤维形态，其直径分布也小于醇溶液电纺得到的纤维（图5）。玉米醇溶蛋白纳米纤维膜的机械性能无法满足食品工业的需要，Yao 等[29]通过己二异氰酸酯交联，将玉米醇溶蛋白纳米纤维膜的机械强度增加了一倍。戊二醛也常用于玉米醇溶蛋白纤维交联从而提高其机械性能和溶剂稳定性[30]。不同于动物源蛋白，玉米醇溶蛋白常被应用于生物活性物质包埋以及活性包装[31]。Wang 等[32]将原花青素包埋于玉米醇溶蛋白纳米纤维中得到了具有抗氧化以及缓释功能的纤维膜。Wang 等[33]将姜黄素包埋后得到了具有抑菌功能的玉米醇溶蛋白纳米纤维膜。姜黄素-玉米醇溶蛋白纳米纤维膜还被应用于微量Fe3+的检测[34]。槲皮素、多酚、银离子等都曾被包埋于玉米醇溶蛋白纳米纤维[35-36]。

图5 柱状（a）和缎带状（b）形态玉米醇溶蛋白纤维Fig.5 The round morphology （a） and ribbon morphology （b） of zein nanofibers

2.4 乳清蛋白

乳清蛋白是一种球蛋白，含有β-乳球蛋白、α-乳白蛋白、免疫球蛋白和血清白蛋白，在食品行业通常用于包埋。由于乳清蛋白的球状结构，无法单独形成足够的分子缠联从而形成纳米纤维。López-Rubio 和Lagaron[37]将40%的WPI 水溶液进行电喷得到了直径100～2 000 nm 的微球，并且能够通过调节pH 改变其直径分布，以甘油作为助溶剂将β-胡萝卜素包埋其中起到了延缓其氧化的作用。向WPI 溶液（10%）中添加0.4%的PEO，在酸性条件下（pH 1）能够电纺得到直径700 nm左右的纳米纤维[38]。Sullivan 等[39]发现通过热处理能够提高WPI/PEO 纳米纤维膜在水溶液中的稳定性。Pérez-Masiá 等[40]对比了电喷与普通喷雾干燥对叶酸包埋效果的影响，发现两种技术在包封率上没有显著差异，而电喷的过程不会让活性物质发生热变形，并且也不需要挥发性有机溶剂，对活性物质能够起到更好的保护作用。该课题组同样发现电喷得到的WPI 微球对α-亚麻酸有显著地保护效果，而普通喷雾干燥造成了脂肪酸氧化[41]。

表1 常见蛋白电纺所用溶剂Table 1 The lists of some common solvents for protein electrospinning

3 静电纺丝多糖

3.1 壳聚糖

壳聚糖是一种氨基多糖，来源于去乙酰化的甲壳素。由于壳聚糖具有抑菌性和良好的生物相容性、降解性，壳聚糖电纺膜一直备受关注。壳聚糖在极少数的溶剂中能够实现单组分电纺，Ohkawa 等[43]将8%壳聚糖溶于三氟乙酸中能够形成几乎没有串珠的纤维，并且通过向溶剂中加入二氯甲烷能够显著改善纤维形态形成完全无串珠结构。发现7%的壳聚糖溶于高浓度（90%）乙酸中能够实现壳聚糖单组分电纺，然而只有中等分子质量的壳聚糖能够成功电纺，而且电场电压要高于4 kV/cm[44]。由于酸溶液电纺得到的壳聚糖电纺膜在中性以及弱碱性环境中易溶解，通常采用饱和Na2CO3溶液中和[45]以及戊二醛、京平尼、ECH等交联的方法[46-47]。壳聚糖单组分电纺受制于壳聚糖分子质量、电压、溶剂等的限制，大部分研究都将壳聚糖与合成高分子，如PEO，PCL，PVA 等进行共纺，从而提高壳聚糖溶液的可纺性[48-50]。也有大量研究将壳聚糖与其它天然高分子，如明胶、玉米醇溶蛋白、丝素蛋白等进行共纺，从而得到综合性能更优良的电纺膜[51-53]。壳聚糖纳米纤维膜具有一定的抑菌性所以能够被用于促进愈伤修复[53]。也有很多研究将抑菌物质包埋于壳聚糖纳米纤维中得到抑菌性能良好的包装材料[54]。壳聚糖/PLA纳米纤维膜还被用于脂肪酶固定从而提高脂肪酶的回收效率和利用次数[55]。Mendes 等[56]将壳聚糖与磷脂共纺得到纳米纤维用于药物缓释，将维生素B12、姜黄素、双氯芬酸作为模式药物发现该体系可用于经皮给药[56]。本课题组研究发现将LAE添加到壳聚糖纳米纤维中能够有效提升壳聚糖的抑菌效果（图6）。

图6 不同LAE 含量的壳聚糖纳米纤维膜对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制作用Fig.6 The inhibition effect of LAE encapsulated chitosan nanofibers against Escherichia coli and Staphylococcus aureus

3.2 纤维素

纤维素是自然界含量最丰富的多糖，由几百至几千个β（1→4）连接的D-葡萄糖单元的线性链（糖苷键）组成。用于直接电纺纤维素的溶剂有LiCl/DMAc，NMMO/水体系，乙二胺/硫氰酸钾体系[57-58]。已有研究表明电纺纤维素溶剂选择十分严苛，以及非挥发性溶剂残留的问题，因此很多研究者通过电纺乙基纤维素得到纳米纤维后再用碱溶液进行处理后得到纤维素纳米纤维[59]。研究了丙酮、DMAc、乙酸三元体系对乙基纤维素电纺的影响，发现3 种溶剂单独都难以形成良好的乙基纤维素纳米纤维，乙酸/DMAc 体系形成了带串珠的纤维，丙酮/DMAc 体系能够形成形态良好的纤维[60]。Ma 等[59]采用了丙酮/DMF/三氟乙烯（3∶1∶1，体积比）体系作为溶剂，电纺得到的纳米纤维膜呈“棉絮状”，表现为纤维之间粘连不够，膜很蓬松，机械性能差。Han 等[61]研究了水/乙酸体系作为溶剂对乙基纤维素电纺的影响，发现形态良好的纳米纤维在乙酸体积分数大于70%的溶剂体系得以形成，随着乙酸体积分数的增加纤维直径也相应增加。在本课题组近期的研究中采用水/乙醇/乙酸（2∶2∶6，体积比）体系作为乙基纤维素的溶剂并且得到了直径600 nm 左右形态良好的纳米纤维[62]。

由于纤维素分子中含有大量的羟基，具备良好的亲水性、生物相容性和反应性，纤维素纳米纤维素被应用于制备亲和膜[59]，乙基纤维素纤维膜被应用于水处理中重金属离子的吸附[63]。通过电纺乙基纤维素纳米纤维，中和后得到纤维素纳米纤维膜被用于脂肪酶固定化[64]。也有大量研究将乙基纤维素应用于活性物质包埋及缓释，起到药物传递、抑菌、伤口修复的作用[65-67]。

3.3 海藻酸钠

海藻酸钠是一种从天然褐藻中提取的线性聚糖醛酸，其分子主链由甘露糖醛酸单元和古罗糖醛酸单元不规则连接组成。海藻酸钠是水溶性聚合物，早期研究集中在海藻酸钠与其它合成多聚物，如PVA 或PEO 的混合水溶液体系的电纺[68-69]。Nie 等[70]认为海藻酸钠水溶液难以单独电纺是由于其分子间形成的氢键使得其分子链形成了刚性的“蠕虫状”，从而难以提供足够的缠联从而成功电纺。该研究团队通过向海藻酸钠水溶液中添加甘油来破坏海藻酸钠分子间的氢键作用从而实现海藻酸钠在水/甘油溶液中的单独电纺（图7），甘油/水比例≥1 时，0.02 g/mL 海藻酸钠可电纺得到形态良好的纳米纤维。Moon 和Farris[71]通过提高电纺温度的方式成功电纺了明胶/海藻酸钠水溶液。Fang 等[72]发现以水/乙醇/DMF（75∶15∶10，体积比） 为溶剂的海藻酸钠溶液中添加少量CaCl2能够提高溶液的可纺性。近期研究发现在普鲁士多糖/海藻酸钠水溶液无针共纺体系中加入少量的CaCl2能够显著降低纤维直径并且提高纤维的热稳定性[73]。由于海藻酸钠与钙离子能够形成凝胶，可以利用这一性质对海藻酸钠纤维膜进行钙离子处理从而加强海藻酸钠纤维膜的水溶液稳定性[74]。海藻酸钠纳米纤维膜被应用于组织工程、活性包装、酶固定化以及重金属吸附等[75-78]。

图7 海藻酸钠中加入甘油后分子作用机理示意图Fig.7 Schematic illustration of the interaction between sodium alginate and water or glycerol

3.4 葡聚糖

葡聚糖是一种细菌多糖，由α-1，6-键连接D-吡喃葡萄糖，侧链由α-1，2-，α-1，3-或者α-1，4-连接。葡聚糖（1 g/mL）溶解在DMSO/水和DMSO/DMF 溶剂体系中能够得到形态良好的纳米纤维[79]。Ritcharoen 等[80]以纯水为溶剂，分子质量64～76 ku 的葡聚糖为原料，质量浓度为0.9～1.3 g/mL时能够成功电纺得到纳米纤维，通过戊二醛交联以及氯化镁添加能够提高葡聚糖纳米纤维膜的水溶液稳定性。葡聚糖通常与一些合成高分子共纺后被应用于组织工程[81-82]。

4 总结

天然高分子由于其安全性、生物相容性、生物可降解性受到越来越多静电纺丝研究者的关注。然而，天然高分子在静电纺丝过程中由于其分子质量分布广，生产批次不同造成分子质量分布差异，对天然高分子电纺膜产业化应用提出了挑战。过去几十年的研究表明已经可以通过原料的分子质量、浓度、流变性质等预测以及精准控制溶液的可纺性。天然高分子电纺膜也已经在活性包装、酶固定化、组织工程、药物缓释、膜处理等方面表现出了极大的应用价值。

表2 常见多糖电纺所用溶剂Table 2 The lists of some common solvents for polysaccharide electrospinning