废油脂生物合成聚羟基脂肪酸酯的研究进展

潘兰佳 李杰 林清怀 汪印

（1. 厦门产业技术研究院，厦门 361000；2. 中国科学院城市环境研究所，中国科学院城市污染物转化重点实验室，厦门361021）

聚羟基脂肪酸酯（Polyhydroxyalkanoate，PHA）是微生物细胞内的碳源在氮、磷或硫被限制的条件下的代谢转化而产生的［1］，是一种可完全生物降解的高分子生物聚酯，其在降解过程中不产生任何有毒化合物［2］。由于PHA具有热塑性、生物降解性和生物相容性等优点，被视为石油工业塑料的理想替代品，但其较高的生产成本，限制了PHA的产业化生产和大规模应用。目前，工业PHA的价格在2-8美元/kg不等，传统的聚乙烯和聚丙烯大约只要1.6-1.7美元/kg［3］。然而，为了评估塑料的真实成本，我们必须考虑其对环境的影响和环境修复相关的财政损失［4］。世界各国的研究者们正努力通过各种研究降低PHA的生产成本，可降解的环保塑料必将是未来的发展趋势。微生物发酵过程中，底物消耗占比较大，选择价格低廉的底物可以一定程度上降低PHA的生产成本［5］。利用废弃物作为碳源合成PHA，一方面可解决资源的浪费以及废弃物污染问题，同时可以降低PHA的生产成本，这将进一步促进PHA的生产和应用。目前被用于PHA生产的废弃物包括乳清［6-7］、麦麸、米糠［8］、甘蔗糖蜜［9］、废水［10］和废油［11］等。本文重点介绍微生物利用废弃油脂合成PHA。

油脂是人类日常饮食中不可缺少的重要组成部分，它的主要功能是提供热量以及人体无法合成的脂肪酸和各种脂溶性维生素。据有关部门统计，2010年，我国年消费的食用油约为2 900万t，产生的废油量约600万t，预计到2020年，我国的食用油消费量将成倍增长，而相应的废油产出量将超过1 000万t［12］。另外，油脂还具有十分重要的工业用途。一些动、植物油可被用于制作肥皂、表面活性剂和生物柴油等，这些物质生产过程中产生的废油脂或者副产物积累，将给环境和人类带来巨大的压力。因为大量的废油脂处理不当，会使得有害物质流入生态系统，不仅污染环境，还会危害人体健康。油脂的主要成分是脂肪酸、甘油、维生素和植物甾醇。其作为一种碳氢化合物，可被微生物以碳源形式利用。通过废弃油脂生物合成可降解塑料-PHA，一方面可以解决废油脂处理不当带来的环境污染问题，同时可以实现废弃物的资源循环利用。

1 PHA在不同领域的应用

聚羟基脂肪酸酯（PHA）是微生物细胞内碳源和能源的贮藏物质，当培养基中生长所必需的营养物质含量有限，而碳源物质过多时，会促进PHA的积累。这种碳储存被细菌作为脂肪酸的替代来源，在一定压力条件下可对其进行代谢，这是它们生存的关键机制［13］。到目前为止，已发现包括光能自养菌、化能自养菌和异养菌在内的65个属300 多个种的微生物细胞可合成PHA［14］，其中包括产碱杆菌属（Alcaligenes）、假单胞菌属（Pseudomonas）、肠杆菌属（Enterobacter）、红杆菌属（Rhodobacter）、罗尔斯通菌属（Ralstonia）和贪铜菌属（Cupriavidus）的细菌。PHA的基本结构及其在细胞中的存在状态如图1所示。据统计，至今已有150多种不同结构的PHA被发现。根据单体的碳原子数，PHA可以被分为两类:短链（Short-chain-length，SCL）PHA，其单体由3-5个碳原子组成；中长链（Medium-chain-length，MCL）PHA，其单体由6-14个碳原子组成，其分子量多为50 000-20 000 000 Da不等［13］。不同的 PHA单体主要区别于C-3位上侧链基团的不同，现以侧链为甲基的聚3-羟基丁酸酯（Poly3-hydroxybutyrate，PHB）最为常见［15］。由于PHA的单体种类多样、彼此之间链长差别很大，导致不同的PHA 物理化学结构和材料学性质有很大的差异［2］。当PHA为短链时，具有良好的热塑性；PHA为中长链时，具有良好的弹性［16］。PHA具有许多和聚丙烯塑料类似的性质，如具有良好的防潮性能、气体阻隔性、抗水解性和耐紫外线的性能等。除此之外，PHA还具有一些独特的性质，包括生物相容性、生物降解性［17］和光学异构性［18］，甚至具有压电材料的特性，其在塑料包装、化工、医药、农业、生物能源等诸多领域具有广阔的应用前景（图2）。

图1 PHA的结构式及其在细胞中的存在状态［19］

PHA在塑料工业领域经历了四代产品的更新换代。第四代PHA材料是3-羟基丁酸-4-羟基丁酸共聚酯（P3HB4HB），可通过调节其单体比例，获得所需性能的材料，由于其具有生物降解性，已成为制造绿色包装材料的首选原料。PHA可以用于生产各种产品，包括塑料袋、餐具、化妆品容器和食品包装材料等［20］。另外，PHA良好的免疫耐受性、低毒性、生物降解和生物相容性，使其在医药行业具有广阔的应用前景。首先，可用于外科缝合、皮肤替代品、植入物、纱布、血管、组织支架和骨折固定板等［21］。聚羟基辛酸酯和聚4-羟基丁酸酯由于柔韧性较强，最早被应用于血管组织工程的研究；短链 PHA，如 PHB 和 3-羟基丁酸-3-羟基戊酸共聚酯（PHBV）可作为构建骨组织工程支架的原料［22］。另外，PHA还可制备缓释材料，作为药物基质植入人体后，随着药物释放，能降解为可被人体自行代谢而没有任何毒副作用的物质［23］。近几十年来，可生物降解聚合物还以纳米颗粒、纳米胶囊、微颗粒、微胶囊和微/纳米球等形式作为药物载体，得到了广泛的应用［16，24］。以PHB微球为载体，制备的抗肿瘤药物在小鼠体内的实验结果表明，含有变红菌素的PHB微球作为抗肿瘤药物可有效抑制癌细胞的增殖［25］。在农业方面，PHA已被用作农业用途的地膜制造［26］，还可以作为除草剂的载体和控释剂，控制释放以减少除草剂对非目标物种的影响和重复使用的需要［27］。在畜牧业方面，PHA可作为饲料添加剂为动物提供额外的营养物质［28］。已有研究表明水产养殖水体中加入PHA可有效控制水中病原菌的生长，防止水产动物感染，并且促进动物生长［29］。另外，PHA还可制成生物燃料，其水解后再经甲基酯化反应可生成3-羟基烷酸酯甲酯，其能量可与生物乙醇相媲美［30-31］；由于PHA还具有光学活性，可应用于色谱中分离手性物质。在环保材料方面，PHB还被成功制备为吸附剂，可去除水中脂溶性有机污染物的能力［32］。而且现在十分热门的纳米材料也希望通过PHA的添加形成复合材料，获得更优异的性能［26］。

2 微生物利用废油脂合成PHA

2.1 餐厨废油

图2 PHA在不同领域的应用

餐厨废油一般是指地沟油、潲水油、煎炸废油、动物废弃油脂等［33］。在过去的几十年里，食用油回收行业得到了大力发展。餐厨废油不再被视为废弃物，而是成为一种有价值的商品，尤其是用于生物柴油生产。餐厨废油具有低市场价值，高含碳量等优点，可作为微生物培养的有效碳源［34］。目前已有多项研究对其生物转化为PHA的潜力进行了评价。以餐厨废油作为PHA的合成底物，可以至少降低50%的生产成本。而且有研究者发现利用油脂合成PHA的能耗以及CO2的排放量少于利用葡萄糖作为底物合成PHA的值［35］。

近年来，关于微生物利用餐厨废油合成PHA的研究大多数是利用单一组分的油为底物，而利用混合废油（煎、炸、炒、蒸、煮等餐厨混合废油）为底物的研究较少。Obruca等［36］以废弃菜籽油为底物，利用Cupriavidus necatorH16生产PHB，通过连续培养，72 h 之后PHB产量可达105 g/L，并且发现1%丙醇（V/V））可以显著促进PHA和生物量的累积。Obruca等［7］还发现利用煎炸废油为碳源，蛋白酶水解的乳清为氮源，Cupriavidus necatorH16在70 h可合成14.5 g PHB。与其它氮源相比，利用水解乳清为氮源，PHB的累积量提高了3.5倍以上。Verlinden等［37］同样利用Cupriavidus necator为实验菌种，以煎炸废油为底物生产PHA，72 h产量可达1.2 g/L。种宇轩等［38］以煎炸废油作为发酵过程中的碳源，对Cupriavidus necator合成PHA过程进行了条件优化，结果表明当初使pH值为7.5、装液量为100 mL/250 mL、培养温度为28℃、接种量为3%、转速为160 r/min、废油添加量为25 mL/L进行发酵培养时，PHA的产量可达到6.63 g/L，约占到细胞干重的83%。根据文献报道，菌种Cupriavidus necator已成为利用脂质类底物生产PHA的常用菌株，并且有研究者尝试用其以混合的餐厨废油为底物合成PHB，结果显示其对PHB的积累在2 d之内可以达到细胞干重的63%左右［39］。Cruz等［40］通过溶氧控制补料模式以及氢氧化铵同时作为pH调节剂和氮源的方式，使得菌株Cupriavidus necatorDSM 428利用餐厨废油合成PHB的效率达到12.6 g/L/d。另一常用的以油脂为底物合成PHA的菌种为真氧产碱杆菌（Ralstonia eutropha）。Kahar 等［41］利用Ralstonia eutrophaH16 为实验菌种，以廉价大豆油为碳源生产PHA，产物含量可达细胞干重的72%-76%（W/W）。Park等［42］研究了菌株Ralstonia eutrophaKCTC 2662以及大豆油合成PHA的能力发现，其以大豆油为单一碳源合成的PHA可占菌体细胞干重的70%-83%，产率为0.80-0.82 g-PHA/g-油。另外，一些假单胞菌和伯克霍尔德菌也可将餐厨废油转化为PHA。Fernandez等［43］通过Pseudomonas aeruginosa 42A2 利用废弃的烹饪油和其他废油生产PHA，该菌株可以积累54.6%的PHA。菌株Burkholderia thailandensis最早是从泰国中部某稻田土壤样品中分离得到的。Kourmentza等［44］首次报道通过B. thailandensis利用餐厨废油合成PHA，并发现合成的PHA是PHB均聚物。

2.2 其它废油

生物柴油作为一种典型的绿色能源，受到各界普遍关注。但生物柴油生产过程中会有大量的副产物甘油累积，而甘油中较多的杂质使其利用价值较低。因此，利用甘油作为合成PHA的低成本碳源也受到广泛的关注。Canadas等［45］将废弃的甘油作为菌株Cupriavidus necatorDSM 545合成PHA的主要碳源，聚合物的浓度可以达到9-25 g/L，并成功将该聚合物制备为用于干细胞培养的电纺纤维支架。de Paula等［46］从土壤中分离得到一株新菌Burkholderia glumaeMA13，其以粗甘油为单一碳源可合成PHB（含量可达菌体干重的51.3%），该菌在甘油外加丙酸或己酸则可合成3-羟基丁酸-3-羟基戊酸共聚酯或3-羟基丁酸-3-羟基己酸共聚酯，有效改善PHB聚合物的性质。Mohandas等［47］首次报道了海洋嗜盐菌Bacillus cereus可将甘油转化为PHA，最佳条件下PHA的含量可达68.12%。粗甘油还通过假单胞菌合成均匀性较好的中链PHA，有利于其在工业上的应用［48］。此外，一些其它的废油脂，如咖啡渣废油、废弃棕榈油等也具有合成PHA的潜力。咖啡作为仅次于石油的世界第二大贸易商品，消耗之后将留有大量残渣。将咖啡渣收集，并作为生产其它高值化产品的原料，将在一定程度上减轻环境压力，降低生产成本。目前，咖啡渣提炼的废油已被用于生产 PHB［49-50］。Bhatia等［51］利用工程菌以咖啡油为底物合成3-羟基丁酸-3-羟基己酸共聚酯，该聚合物的产量可达到菌体细胞干重的69%。棕榈油是食用油的一种，不仅在食品和餐饮行业被广泛应用，还常用于工业生产。棕榈油用于制造肥皂后的皂化残油难以回收再利用，有研究者以其作为合成PHA的原料，通过菌株Pseudomonas sp. Gl01的转化，中链PHA的含量可以达到43%［52］。本着废物再利用原则，另有学者利用生产人造奶油过程中产生的含油废物为原料，利用菌株Cupriavidus necator，Comamonas testosteroni和多种假单胞菌进行转化合成。Cupriavidus necator的效果最佳，20 h的PHA产量为6.4 g/L［53］。还有研究者利用植物油生产过程产生的废水和污泥中的残油进行PHA合成实验，结果表明该物质在合成PHA方面具有较高的潜力［54-55］。

2.3 油脂合成PHA的转化机制和难点

油脂与其它碳源不同，其理论PHA的产额系数每克植物油可合成超过1.0 g PHA，因为油脂碳链长，可以水解为许多短链的脂肪酸，而脂肪酸通过β-氧化途径被利用，直接生成PHA的前体—酰基辅酶A［7］。如图3所示，为了达到废油脂合成PHA的目的，可以首先在酸性或碱性条件下使油脂水解为脂肪酸，水解产物与PHA合成菌共同培养之后，脂肪酸进入菌体细胞在转运蛋白和酰基辅酶A合成酶的作用下生成酰基辅酶A。短链PHA即聚羟基丁酸酯是由乙酰辅酶A直接在β-酮硫解酶和乙酰乙酰辅酶A还原酶的作用下生成［51］；而对于大部分中链PHA则是酰基辅酶A经过脱氢反应生成烯脂酰辅酶A，该物质再经过烯脂酰辅酶A水合酶的作用生成羟烷基辅酶A，进一步在PHA合成酶催化生成PHA。在整个β-氧化的过程中，羟烷基辅酶A会通过循环部分分流，在烷基辅酶A脱氢酶（fadB）作用下生成酮脂酰酶A。因此，为了促进PHA的合成量，可以考虑敲除基因fadB，甚至是将fadB和fadA两个基因都敲除，减少烷基辅酶A的代谢通量。酮脂酰酶A硫解酶（fadA）和羟烷基辅酶A脱氢酶（fadB）是催化β-氧化过程的两个重要的酶。多项研究表明fadA、fadB两个基因敲除以后，产生的突变体可以合成比野生菌株更多的PHA［56-58］。但是以上提及的基因敲除实验都是基于菌株利用纯的、单一的脂肪酸来合成PHA，关于利用废油脂为底物的研究尚未有发现。废油脂成份复杂，脂肪酸组分复杂，具体的基因敲除效果导致的PHA合成和菌体生长情况还需要进一步实验验证。

虽然废油的利用是有利的，但杂质的存在和每次废油成分的变化也会导致最终PHA产量的变化。这些因素造成不同的产出，在进行批量试验之前需在实验室规模上进行实验优化。因为一旦使用了新一批的废油，就会导致额外的成本和产出的不确定性［59］。另外，虽然利用废油合成PHA与减少废油处理问题存在实质利益有关，但笔者建议废油合成PHA的成品不能用于医疗应用。因为在医疗应用中，最需要考虑的是材料的安全性和无毒性。废油脂生产的PHA可能具有病毒、质粒、细菌或其它污染，使其无法用于医疗级别的应用［60］。如果废油脂生产的PHA要用于医疗，一些杂质则需经过多重步骤的纯化去除，但最终会导致产品成本增加。

图3 油脂合成PHA的途径和相关控制基因［21，51］

3 PHA的提取方法

PHA在微生物细胞内积累，因此为了得到它，要将其与非PHA等细胞物质分离。图4为PHA提取的流程图，简单介绍了PHA从微生物细胞到高纯度成品的几个步骤。菌体在进行PHA提取之前，首先要通过离心收集，以油脂作为合成底物的需要利用正己烷将菌体表明的油脂去除，并用去离子水洗涤。获得的菌体经过冷冻干燥处理之后可用于提取步骤。许多研究显示，PHA可以通过利用多种不同的溶剂萃取获得。该方法不但提取出的PHA纯度高，而且能保持生物聚合物的理化性质不改变。另外，在提取之前，对细胞进行研磨、高压均化、超声破碎等前处理，可以提高PHA的提出率。以下主要介绍几种常用的PHA提取方法。

图4 PHA分离纯化流程图

3.1 有机溶剂提取法

PHA提取常用的方法为索氏提取法。直接利用有机溶剂在高温下抽提冻干的微生物细胞中的PHA，使用的有机溶剂多数为氯仿。抽提结束后冷却、过滤，随之将氯仿相逐滴滴入冷甲醇中。冷甲醇作为非溶剂，PHA会在其中沉淀析出，最后通过离心、干燥获得PHA［44，61］。另外，还可直接使用有机溶剂提取，省去索氏提取的步骤和装置，先将冻干的细胞破碎后加入有机溶剂，在高温下提取。一段时间后，过滤获得的有机相同样通过非溶剂法沉淀析出PHA。Taniguchi等［61］利用有机溶剂提取法提取PHA是直接将干的细胞置于氯仿中，在室温下提取3 d。López-Cuellar等［62］直接将细胞加入氯仿中煮沸10 min，过滤后利用冷甲醇析出PHA。Simon-Colin等［63］利用研钵将冻干的细胞磨碎后加入氯仿中，在50℃下提取4 h。之后将氯仿相浓缩，去除杂质后蒸干氯仿获得粗提的PHA。除了氯仿之外，二氯乙烷、丙酮、乙酸乙酯、正己烷等有机溶剂也被用于从破裂的细胞生物质中溶解PHA。其它的有机溶剂如四氢呋喃甲基氰、四氢呋喃乙基氰和乙酸酐等也被尝试使用，但这些试剂的提取回收率并不高。溶剂萃取法获得的PHA纯度高且不降解聚合物，还能去除细胞的内毒素［64］。但有机溶剂的污染大，使用后需要考虑回收问题。

3.2 双水相萃取法（Aqueous two phase extraction，ATPE）

双水相萃取（ATPE）是一种独特的液-液萃取技术，它将溶质从一个水相转移到另一个水相。ATPE通常包括聚合物-聚合物型和聚合物-无机盐型两种体系［65］。在水中以一定的浓度混合后形成的互不相溶性的两相或多相，并利用溶质在两相的分配系数的差异进行萃取。由于双水相体系含水量高达70%-90%，是在接近生理环境的温度和体系中进行萃取［21，66］，并且该体系对生物分子具有较高的选择性和回收率［67］，因此它被广泛应用于生物技术领域分离纯化各种生物制品，如氨基酸、酶、抗体等［68］。该法近年也被用于PHA的提取，与溶剂萃取法相比双水相萃取是一种环保的提取方法［69］。双水相体系统采用水相分离纯化PHA，并且可以从中去除不需要的杂质［16］。Divyashree等［70］利用双水相萃取法从弯曲芽胞杆菌中提取PHA回收率可达51%，利用的两相分别是12%（W/V）聚乙二醇和9.7%（W/V）磷酸钾。现还有利用热分离聚合物和水组成的新型双水相体系对PHA进行分离。常用的热分离聚合物是环氧乙烷（Ethylene oxide，EO）和环氧丙烷（Propylene oxide，PO）的随机共聚物（简称EOPO聚合物），其溶液随着温度的升高热分解为两相。最终目标产物可以在水相中回收，而共聚物可以回收再利用。Leong等［71］在EOPO 3900浓度为14 wt/wt%，硫酸铵浓度为14 wt/wt%，pH为6的条件下进行细菌细胞中的PHA提取，过程中无需额外离心步骤，PHA的回收率可达72.2%。

3.3 消化法

消化法是溶剂萃取法的替代方法，包括化学法消化和酶法消化。这两种都能消化细胞中的非PHA物质。在化学方法中，通常使用表面活性剂或次氯酸钠来促进细胞中PHA的释放。表面活性剂如十二烷基硫酸钠（Sodium dodecyl sulfate，SDS）可以通过与细胞的磷脂膜结合从而破坏细胞，使得PHA以细胞碎屑的形式释放。表面活性剂还有溶解蛋白质和其它非PHA物质的作用［72］。但是，单独使用表面活性剂获得的PHA纯度不高，因此需要同时添加一些别的物质如次氯酸盐和氢氧化钠［73］。表面活性剂Triton X-100、棕榈酰肉碱和甜菜碱均用于化学消化。另一种化学消化是次氯酸钠消化，但仅用次氯酸钠会导致高达50%的聚合物被降解。因此，最终发展为次氯酸钠和氯仿消化法，结合次氯酸钠消化法和溶剂提取法的优点，通过次氯酸钠破坏细胞并消化非PHA物质，同时利用氯仿将PHA提取至有机相部分［73］。酶消化包括热处理、酶水解和表面活性剂洗涤等步骤［64］。由于酶具有特异的靶向性，一些酶（如蛋白酶）对蛋白质具有较高的溶解性，而对PHA几乎无影响，因此 PHA的回收率较高。酶法消解最主要的缺陷在于其成本较高。

3.4 其它方法

超临界流体具有气体和液体的双重特性，其黏度与气体相似，但扩散系数比液体大得多，其密度和液体相近。超临界流体对物质进行溶解和分离的过程就叫超临界流体萃取。超临界溶剂萃取法具有低毒性和低成本等优点，其中超临界二氧化碳由于其温和的温度和压力，被用于工业上的细菌PHA提取。除二氧化碳气体外，超临界流体法还可用氨和甲醇对进行PHA回收［74］。与传统萃取工艺相比，超临界溶剂萃取法可使回收的PHA纯度达到100%，杂质含量比传统萃取工艺的少150倍［16］。

4 总结和展望

聚羟基脂肪酸酯（PHA）作为一种绿色塑料，在生产和回收方面具有积极的社会和环境影响。但由于其生产成本高昂，发展受到极大限制，价格与普通的聚丙烯塑料相比没有竞争优势。使用废弃物作为碳源生产PHA将是一个研究热点。利用废油脂合成PHA，一方面可以为废油资源化利用开辟新的途径；另一方面合成的环境友好型材料可替代传统塑料，减轻环境污染。已有的相关研究大多数还处在实验室规模的实验阶段，距离真正实现废油脂合成PHA的商业化程度还有很大差距、需要进行大量的研发。并且需要考虑如下几个问题:（1）餐厨废油成分复杂，其中不可避免含有对发酵微生物生长不利的物质，导致PHA的合成效率较低，因此需要如何提高微生物利用废油脂合成PHA的效率；（2）复杂的成分会导致合成的PHA为多种单体的混合物，此情况是否会影响PHA的物理化学性质；（3）如何将不同的PHA单体有效分离或是能通过什么方式使其仅合成一种单体，这都将是有待解决的重要问题。另外，在实验室层次的研究，对于PHA的提取大多使用的是有机溶剂提取法，扩大生产之后使用此方法，则将消耗大量的有机溶剂，对环境造成威胁，进而违背我们可持续发展的初衷。因此，还需大力开发有效、经济且环保的PHA提取方法，从多方面控制PHA的生产成本、消耗和排放。