miR-21通过靶向PDCD4调控三阴性乳腺癌细胞的迁移和侵袭

陈绵龄，马硕一

(1．广州市第一人民医院，华南理工大学附属第二医院乳腺外科，广东 广州 510180；2．广州市第一人民医院，华南理工大学附属第二医院介入科，广东 广州 510180)

乳腺癌是导致全世界女性癌症死亡的主要原因。在中国，乳腺癌的发病率居女性恶性肿瘤的首位。三阴性乳腺癌是乳腺癌中恶性程度较高的一种亚型，预后较差，由于其缺少雌激素受体(estrogen receptor，ER)、孕激素受体(progestrogen receptor，PR)和人表皮生长因子受体-2(human epithelial growth factor receptor-2，HER-2)的表达，内分泌治疗和针对HER2的靶向治疗无效，因此寻找新的治疗靶点具有重要意义。

小分子核糖核酸(microRNA，miRNA)是一组具有长21～23个核苷酸的非编码单链RNA，可以调控多个重要的生物学过程，比如癌细胞生长、凋亡和转移等。其中，miR-21在多种癌症中过度表达并且起促癌作用，包括乳腺癌[1-2]、肝癌[3]、胰腺癌[4]和结直肠癌[5]等。研究发现，在HER-2阳性的乳腺癌患者中，miR-21通过调节上皮-间充质转化影响患者对曲妥珠单抗治疗和化疗的反应[6]。

程序性细胞凋亡因子4基因(programmed cell death 4，PDCD4)是凋亡因子家族的成员之一，其表达的丢失和多种肿瘤的发生和进展相关，包括胶质瘤[7]、胶质母细胞瘤[8]和卵巢癌[9]等。在细胞的凋亡过程中，过度表达的PDCD4蛋白可以抑制癌细胞的肿瘤源性。在ER阳性乳腺癌中，PDCD4下调和芳香化酶抑制剂耐药以及较差的预后相关[10]。

研究表明在乳腺癌细胞中PDCD4是miR-21的功能性靶点，miR-21可以抑制乳腺癌细胞生长[11]。但是，目前尚无研究揭示miR-21靶向PDCD4调控三阴性乳腺癌增殖、迁移和侵袭。因此本研究拟探讨miR-21和PDCD4在三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231和正常乳腺细胞MCF-10A中的表达，以及miR-21是否靶向调控PDCD4影响MDA-MB-231细胞的迁移和侵袭。本研究为进一步阐明乳腺癌转移的分子机制提供一定的依据，miR-21可能成为抑制三阴性乳腺癌转移的靶点。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器

马血清，购于美国Gibco公司；表皮生长因子、霍乱毒素、胰岛素、氢化可的松、DMEM培养基、胰酶，Trizol裂解液、LipofectamineTMRNAiMAX，购于美国Invitrogen公司；SYBR Green PCR Master Mix购自日本TOYOBO公司；Taqman microRNA试剂盒购自美国Applied Biosystems公司；荧光素酶报告检测试剂盒购自美国Promega公司；鼠β-actin蛋白购自美国Abcam公司；Transwell小室购自美国Corning公司；miR-21模拟物(mimics)、miR-21抑制物(inhibitor)以及模拟物对照、抑制物对照购自广州锐博生物科技有限公司；ABI PRISM®7500 Sequence Detection System购自美国Applied Biosystems公司。

1.2 细胞培养

人类乳腺癌细胞系MDA-MB-231，购自中科院上海细胞库，用含1%青霉素/庆大霉素和1%谷氨酰胺的DMEM培养基培养。人类正常乳腺细胞系MCF-10A购自美国ATCC公司，用含5%马血清、20 ng/mL表皮生长因子、0.1 mg/mL霍乱毒素、10 mg/mL胰岛素和500 ng/mL氢化可的松的DMEM培养基培养。两种细胞均在37℃、CO2体积分数为5%的培养箱中培养。

1.3 实时定量PCR检测miR-21和PDCD4 mRNA的表达

采用Trizol裂解液提取MDA-MB-231和MCF-10A细胞中的总RNA，通过逆转录试剂盒合成cDNA。采用Primer Epress 3.0软件设计引物，PDCD4和内参18S rRNA的引物信息，以及miR-21和内参U6的引物信息见表1。PCR扩增反应体系总体积为20 μL，包括5.0 μL cDNA、0.5 μL上游引物和0.5 μL下游引物、10 μL SYBR Green PCR Master Mix(2×)和 4 μL dH2O。PCR反应条件为：95℃预变性5 min；95℃、15 s，60℃、15 s，72℃、32 s，40个循环；72℃延伸5 min。产物在ABI PRISM®7500仪器上检测CT值。miR-21的表达采用Taqman microRNA assays定量检测[12]。产物的相对表达采用 2-ΔΔCT法计算。所有的实时定量PCR(quantitativereal-time PCR，qPCR)反应均重复3次。

将MDA-MB-231细胞接种至6孔板，待细胞汇合率约为60%时，随机分为5组：空白对照组，转染miR-21模拟物组，模拟物对照组，转染miR-21抑制物组和抑制物对照组。转染方法参照LipofectamineTMRNAiMAX试剂说明书进行。将1.25 μL miR-21抑制物或模拟物或阴性对照在100 μL Opti-MEM培养基内溶解，加入2 μL LipofectamineTMRNAiMAX试剂。转染结束后，提取总RNA，采用qPCR检测PDCD4 mRNA的表达量。

表1 用于检测PDCD4 mRNA和miR-21的qPCR引物

1.4 Western blot法检测PDCD4蛋白的表达

将MDA-MB-231细胞接种至6孔板，待细胞汇合率约为60%时，随机分为5组：空白对照组，转染miR-21模拟物组，模拟物对照组，转染miR-21抑制物组和抑制物对照组。转染方法参照LipofectamineTMRNAiMAX试剂说明书进行。分别将1.25 μL miR-21抑制物、模拟物或阴性对照在100 μL Opti-MEM培养基内溶解，加入2 μL LipofectamineTMRNAiMAX试剂。转染结束后，细胞用PBS洗3次，然后将6孔板置于冰上，每孔加入150 μL蛋白裂解液，裂解完全后用细胞刮将细胞收集至1.5 mL EP管中，离心，取上清备用。蛋白样品经SDS-PAGE电泳分离后采用湿转法转移到硝酸纤维素膜。醋酸纤维膜经过室温封闭(5%脱脂奶粉)2 h后，置于摇床上用PBST溶液洗膜3次(每次 10 min)，分别加入 PDCD4、β-actin 抗体(1∶1 000稀释)，4℃孵育过夜，洗膜后加入二抗(1∶3 000稀释)在37℃孵育1 h。洗膜后，醋酸纤维膜置于ECL发光液中显影，采用化学荧光成像系统及配套软件采集图像。每组设3个复孔，每次实验重复3次。

1.5 荧光素酶报告基因试剂盒检测miR-21与PDCD4的靶向性

利用microRNA靶标网站(http://www.microrna.org/microrna/home.do)发现miR-21有一个位置被预测和PDCD4 3′-UTR 相连接(图 1)，预测 miR-21 靶向PDCD4。

图1 预测miR-21和PDCD4 3′-UTR有一处连接

将PDCD4的3′-UTR区和突变3′-UTR区构建双荧光素酶报告载体。MDA-MB-231细胞接种在24孔板中，每孔1×105个细胞，将荧光素酶报告载体分别与miR-21抑制物、miR-21模拟物共转染细胞。转染24 h后用荧光素酶报告检测系统检测荧光素酶的活性。所有实验重复3次。

1.6 Transwell小室实验检测迁移和侵袭的细胞数目

1.6.1 迁移实验收集1×105个饥饿状态的MDAMB-231细胞，用100 μL无血清DMEM培养基重悬，加入Transwell小室的上室，在下室加入600 μL DMEM完全培养基。在培养箱中培养12～48 h后，取出小室，用棉签擦去上室的细胞，4%多聚甲醛固定20 min，PBS洗涤1次，结晶紫染色10 min，PBS洗涤1次，显微镜下观察细胞是否穿过小孔，如有穿过终止其他实验组，并拍照统计。

1.6.2 侵袭实验Transwell上层小室铺一层Matrigel，其余操作同迁移实验。

1.7 统计学分析

所有实验结果采用±s表示。MDA-MB-231细胞组和MCF-10A细胞组miR-21和PDCD4指标间差异的分析采用t检验，以α=0.05为检验水准。

2 结果

2.1 miR-21和PDCD4在MDA-MB-231和MCF-10A细胞中表达的差异

我们检测了MDA-MB-231细胞和MCF-10A细胞中miR-21和PDCD4的表达。结果显示miR-21的相对表达水平在MDA-MB-231细胞中显著高于MCF-10A细胞(P＜0.01，图 2A)。PDCD4 mRNA 在 MDA-MB-231细胞中的表达显著低于MCF-10A细胞(P＜0.01，图2B)。

图2 两种细胞中miR-21和PDCD4 mRNA的表达

2.2 MDA-MB-231细胞中miR-21靶向调控PDCD4的表达

为了研究miR-21和PDCD4之间的关系，我们分别增强和抑制了miR-21在MDA-MB-231细胞中的表达。qPCR结果显示MDA-MB-231细胞转染miR-21模拟物增强miR-21的表达后，PDCD4的表达在mRNA水平和蛋白水平均降低。反之，转染miR-21抑制物抑制miR-21的表达后，PDCD4的表达在mRNA水平和蛋白水平明显升高(图3A、B)。

荧光素酶报告基因检测显示过表达miR-21明显抑制PDCD4基因的荧光素酶活性(P＜0.05)(图3C)，而将PDCD4的3′-UTR区突变后，PDCD4基因的活性未受到影响(图 3D)。

2.3 miR-21促进MDA-MB-231细胞的迁移和侵袭

迁移实验结果显示，与空白对照组比较，转染miR-21模拟物过表达miR-21后，MDA-MB-231细胞迁移能力增强；而转染miR-21抑制物抑制miR-21的表达后，细胞迁移能力下降(图4A、B)。

图3 MDA-MB-231细胞中miR-21靶向调控PDCD4的表达

侵袭实验结果显示，与对照组相比，miR-21模拟物转染的MDA-MB-231细胞侵袭能力增强。miR-21抑制物转染的MDA-MB-231细胞侵袭能力下降(图4A、C)。

图4 不同组MDA-MB-231细胞的迁移和侵袭能力

3 讨论

近年来microRNA是肿瘤学的研究热点，在许多恶性肿瘤里起到抑癌或者促癌的作用。这些研究为揭示癌症发生发展的分子机制和探索新的治疗方法带来了新的视角。miR-21在多种肿瘤里具有促癌作用[13-14]。PDCD4基因位于人类10q24染色体，编码185个氨基酸[15]，可以抑制细胞的增殖[16]，增加细胞凋亡[17]。研究发现，PDCD4基因是一个抑癌基因，在各种癌症中表达下调[18-20]，能促进癌细胞凋亡、抑制癌细胞增殖和转移[21-24]。PDCD4抑制癌细胞的转移，其机制可能与下调MAP4K1(有丝分裂原激活的蛋白4激酶1)表达相关[25]。Yu等[26]发现，在胃癌细胞中，幽门螺杆菌通过抑制PDCD4表达来诱导上皮间质转化(EMT)有关。Frankel等[1]发现PDCD4在乳腺癌细胞MCF-7中是miR-21的重要靶点。

我们的研究发现在三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231中miR-21可以调控细胞的迁移和侵袭，具有促癌作用，提示miR-21-PDCD4通路可能成为治疗三阴性乳腺癌的靶点。本研究发现miR-21在MDA-MB-231细胞表达高于正常乳腺细胞MCF-10A。我们进一步探索miR-21在MDA-MB-231细胞中的作用靶点。Target Scan数据库预测miR-21和PDCD4基因3′-UTR有一个连接点。我们首先检测PDCD4的表达，结果发现PDCD4 mRNA在MDA-MB-231细胞中表达水平低于MCF-10A细胞。然后我们采用荧光素酶报告基因实验证实了PDCD4是miR-21的靶基因。通过转染miR-21抑制物，可以观察到PDCD4 mRNA表达升高，而转染miR-21模拟物观察到PDCD4 mRNA降低。这些结果显示miR-21在转录后调控PDCD4的表达。

在转染miR-21模拟物/抑制物后，我们同时进行细胞迁移和侵袭的研究。结果发现转染miR-21模拟物后，细胞迁移和侵袭能力均较空白对照组和未转染的MDA-MB-231细胞显著升高。而转染miR-21抑制物后，细胞迁移和侵袭能力均较空白对照组和未转染的原始MDA-MB-231细胞显著降低。这些结果显示，miR-21在调控MDA-MB-231细胞的迁移和侵袭中发挥重要作用。

综上所述，我们发现在三阴性乳腺癌细胞MDAMB-231中，miR-21通过靶向PDCD4调控细胞的迁移和转移。通过调控miR-21的表达可能成为新的三阴性乳腺癌治疗方法。