长链非编码RNA TINCR通过miR-7调控肝癌细胞系Huh7侵袭和迁移

田小星，秦溧嫔，李 茜

(重庆市第五人民医院 感染性疾病科, 重庆 400062)

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma)的侵袭和迁移与细胞内异常表达的基因调控有关，这些基因通过复杂的调控网络影响肝癌细胞向远端转移[1]。长链非编码RNA(long noncoding RNA,lncRNA)最初被认为是转录“噪音”，人们认为其在生命进程中没有调控功能，随着研究不断深入，人们逐渐发现lncRNA不仅参与正常生理过程，还与疾病的发生有关[2]。在心血管系统疾病以及恶性肿瘤等常见疾病中均发现lncRNA异常表达，lncRNA也逐渐成为靶向治疗疾病的潜在靶点[3]。lncRNA 组织分化诱导非蛋白编码RNA(tissue differentiation inducing non-protein coding RNA,TINCR)参与肿瘤进展，在不同的肿瘤组织中的作用不同，TINCR在前列腺癌等肿瘤中发挥抑制作用，而在非小细胞肺癌等肿瘤中发挥促进作用[4-5]。研究报道显示，TINCR在肝癌组织中的表达水平高于正常癌旁组织，并且TINCR高表达与肝癌患者的预后、淋巴结转移等有关[6]。前期的预实验发现TINCR与miR-7有互补结合位点。miR-7是一个在肝癌中表达下调的肿瘤抑制因子，可以抑制肝癌细胞的侵袭和迁移[7]。本次实验探讨TINCR对肝癌细胞迁移和侵袭的影响和靶向调控机制，为靶向基因治疗肝癌提供资料，为研究肝癌转移分子机制提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

正常肝细胞L-02和肝癌细胞系HCC9204、Huh7、SNU449(ATCC公司)；引物(金斯瑞生物科技股份有限公司)；PrimeScript RT Master Mix试剂盒[宝生物工程(大连)有限公司]；shRNA control、TINCR shRNA(湖南丰晖生物科技有限公司)；MMP-9抗体(Affinity Biosciences公司)；miR-7 mimics、mimics control、inhibitor control、miR-7 inhibitor(上海正茂生物科技有限公司)；MMP-2抗体(北京义翘神州科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 Real-time PCR测定肝癌细胞中TINCR表达变化:收集对数期的正常肝细胞L-02和肝癌细胞HCC9204、Huh7、SNU449，在细胞中添加Trizol裂解试剂，提取细胞总RNA，RNA溶解在DEPC水中，以紫外分光光度计检测A260/A280。cDNA合成用PrimeScript RT Master Mix试剂盒，反转录体系为：1 μL的RT Enzyme Mix Ⅰ、4 μL的5×PrimeCSript RT、1 μL的Oligo dT Primer、1 μL的Random 6 mers、2 μL的RNA，添加RNase Free-H2O补足20 μL；反转录条件为：37 ℃孵育15 min，85 ℃孵育5 s。使用SYBR Premix Ex Taq Ⅱ进行real-time PCR，PCR体系为：0.8 μL的forward和reverse primer、2 μL的cDNA、10 μL的Premix Ex Taq Ⅱ、0.4 μL的ROX Reference DyeII，添加RNase free-H2O补足20 μL；PCR反应条件为：95 ℃ 30 s， 95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，共40个循环。按照2-△△Ct法计算目的基因表达水平。内参基因为GAPDH。引物：TINCR 上游引物： 5′-GCTGAGGTGACGGTCTCAAA-3′，下游引物：5′-GCCTCCCAGTTTCATGGACA-3′。

1.2.2 细胞转染和下调效果测定:将肝癌Huh7细胞分成对照、sh-NC、sh-TINCR组，sh-NC、sh-TINCR组细胞分别为用Lipofectamine 2000转染试剂转染shRNA control、TINCR shRNA的Huh7细胞。转染具体步骤按照Lipofectamine 2000转染试剂说明进行。取培养24 h以后的对照、sh-NC、sh-TINCR组细胞，用real-time PCR方法测定TINCR表达变化，步骤同1.2.1。

1.2.3 CCK-8法测定肝癌细胞增殖:将3组细胞接种到96孔板中，每个孔中添加4 000个细胞、100 μL细胞培养液，将细胞板放在37 ℃的培养箱中培养24 h，将上清吸弃。然后在细胞中添加CCK-8工作液10 μL和100 μL的新鲜细胞培养液。避光反应2 h以后，用全自动酶标仪测定每个孔的A值，检测波长调整为450 nm。

1.2.4 Transwell小室测定肝癌细胞迁移和侵袭:取出在-20 ℃保存的Matrigel，吸取600 μL的不含血清的细胞培养液添加到100 μL的Matrigel中。在放入24孔板中的Transwell小室中添加40 μL的Matrigel稀释液，放在37 ℃孵育30 min将小室湿化。Control、sh-NC、sh-TINCR组共3组细胞用不含血清的细胞培养液悬浮，吸取100 μL添加到小室的上室中，然后在下室中添加500 μL的含血清的细胞培养液，放在37 ℃的培养箱中培养24 h。以冰预冷的4%多聚甲醛溶液固定30 min，然后用0.1%的结晶紫染色10 min。在400×显微镜下随机选取6个视野，计数细胞侵袭数目，结果取均值。细胞迁移实验前不用Matrigel湿化小室，其余步骤与侵袭实验相同。

1.2.5 Western blot测定肝癌细胞中MMP-9和MMP-2蛋白表达:收集对数期的对照、sh-NC、sh-TINCR组共3组细胞，提取细胞总蛋白。在细胞蛋白中加入1/2体积的上样缓冲液充分混合煮沸5 min。SDS-PAGE凝胶电泳蛋白上样量为30 μg，在浓缩胶中使用80V电压电泳至溴酚蓝染料进入分离胶，然后调整到100 V电压电泳至溴酚蓝染料进入凝胶底部边缘1 cm处。取出凝胶，在4 ℃环境下把蛋白电转移到NC膜上，转膜电流设置为200 mA恒流。取出NC膜，放在封闭液(含有5%脱脂奶粉的TBST)中，于室温环境下结合1.5 h；然后放在一抗稀释液(用封闭液按照1∶1 000稀释)中，于4 ℃条件下孵育过夜；最后将NC膜放在二抗稀释液(用封闭液按照1∶4 000稀释的辣根过氧化物酶标记的二抗)中，在室温环境中孵育1.5 h。按照ECL显色试剂盒显色。Image J软件分析条带的灰度值，GAPDH作为内参，分析目的蛋白相对表达量变化。

1.2.6 TINCR靶向关系预测以及鉴定:在线生物学软件targetscan分析TINCR的靶基因，miR-7可能为TINCR的靶基因。构建突变以后的TINCR荧光素酶报告载体(MUT)和没有突变的TINCR荧光素酶报告载体(WT)，将MUT和WT分别同miR-7 mimics、mimics control共转染到Huh7细胞中，培养24 h以后，检测细胞荧光素酶活性变化，检测步骤同荧光素酶活性检测试剂盒。

1.2.7 Real-time PCR方法检测肝癌细胞中miR-7表达:收集对数期的对照、sh-NC、sh-TINCR组共3组细胞，提取细胞总RNA，按照1.2中real-time PCR方法测定miR-7表达变化，内参设置为U6。引物：miR-7 上游引物：5′-TAACACTGTCTGGTAACGAT GT-3′，下游引物： 5′-CCAGTGCAGGGTCCG-3′。

1.2.8 检测miR-7 inhibitor对下调TINCR的肝癌细胞增殖、侵袭和迁移影响:在肝癌Huh7细胞中分别共转染TINCR shRNA、inhibitor control和TINCR shRNA、miR-7 inhibitor，命名为sh-TINCR+Anti-NC、sh-TINCR+Anti-miR-7组，CCK-8法测定增殖(步骤参照1.2.3)，Transwell小室法测定迁移和侵袭(步骤参照1.2.4)，Western blot测定MMP-2和MMP-9蛋白表达(步骤参照1.2.5)。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 TINCR在肝癌细胞中的表达水平高于正常肝细胞

肝癌细胞中TINCR mRNA表达水平高于正常肝细胞(P<0.05)。肝癌Huh7细胞中TINCR表达水平最高(表1)。

表1 TINCR在正常肝细胞L-02和肝癌HCC9204、 Huh7、SNU449细胞中的表达水平

2.2 TINCR shRNA可明显下调肝癌Huh7细胞中TINCR表达水平

Huh7细胞中转染TINCR shRNA以后，细胞中TINCR表达水平明显低于转染shRNA control后的细胞(P<0.05)。TINCR shRNA可明显下调Huh7细胞中TINCR表达水平(表2)。

表2 TINCR shRNA转染以后肝癌Huh7细胞中 TINCR mRNA的表达水平

2.3 下调TINCR可明显降低Huh7细胞增殖、侵袭和迁移能力

Huh7细胞中转染TINCR shRNA以后，细胞A值、迁移数目、侵袭数目和MMP-9、MMP-2蛋白表达量均明显低于转染shRNA control后的细胞(P<0.05)。下调TINCR可明显抑制肝癌Huh7细胞增殖、侵袭和迁移能力(图1,表3)。

表3 TINCR shRNA转染以后肝癌Huh7细胞的A值、迁移数目、侵袭数目以及MMP-9、MMP-2蛋白表达量

图1 Western blot检测TINCR shRNA转染以后肝癌 Huh7细胞中MMP-2和MMP-9蛋白表达Fig 1 Western blot detection of MMP-2 and MMP-9protein expression in liver cancer Huh7 cellsafter TINCR shRNA transfection

2.4 TINCR靶向调控miR-7

TINCR和miR-7有互补结合位点，并且肝癌Huh7细胞中共转染miR-7 mimics和TINCR-WT以后，细胞荧光素酶活性明显低于共转染mimics control和TINCR-WT的细胞(P<0.05)。TINCR靶向调控miR-7(图2，表4)。

图2 生物信息学软件预测TINCR和miR-7结合位点Fig 2 Bioinformatics software predicts TINCR andmiR-7 binding sites

表4 WT和MUT转染以后肝癌Huh7细胞荧光素 酶活性

2.5 下调TINCR可明显促进肝癌Huh7细胞中miR-7表达

肝癌Huh7细胞中转染TINCR shRNA以后，细胞中miR-7表达水平明显高于转染shRNA control后的细胞(P<0.05)。下调TINCR可明显促进肝癌Huh7细胞中miR-7表达(表5)。

表5 TINCR shRNA转染以后肝癌Huh7细胞中 miR-7表达水平

2.6 miR-7 inhibitor可明显促进下调TINCR的肝癌Huh7细胞增殖、侵袭和迁移

与共转染inhibitor control和TINCR shRNA的肝癌Huh7细胞比较，共转染miR-7 inhibitor和TINCR shRNA后的细胞A值、迁移数目、侵袭数目和MMP-2、MMP-9蛋白水平均升高(P<0.05)。miR-7 inhibitor可明显促进下调TINCR的肝癌Huh7细胞增殖、侵袭和迁移(图3,表6)。

表6 miR-7 inhibitor和TINCR shRNA转染后肝癌Huh7细胞A值、迁移数目、侵袭数目和MMP-2、 MMP-9蛋白以及miR-7表达水平

3 讨论

真核生物的绝大多数基因组都会被转录，转录过程中常常产生没有翻译功能的lncRNA，lncRNA主要是由RNA聚合酶II转录形成的，具有调控DNA甲基化、染色质重塑、蛋白质修饰以及影响基因转录等功能，lncRNA作用方式和调控机制多样，在人体的不同生理进程中扮演不同的角色[8]。TINCR具有促进细胞增殖的作用，其参与肿瘤发生，并且在不同的肿瘤中的研究报道不同[4-5]。TINCR在肺癌中表达上调，并且其高表达与肿瘤患者的临床病理特征有关，下调TINCR表达可以抑制肿瘤细胞的恶性转移潜能[5]。TINCR在前列腺癌中扮演肿瘤抑制因子的作用，其可以抑制肿瘤转移[4]。TINCR在肝癌中高表达，TINCR可能是肝癌进展的促进因子[6]。实验表明，TINCR在肝癌细胞中的表达水平高于正常肝细胞，并且下调TINCR可以抑制肝癌细胞增殖，这与上述研究结果相符合，均说明TINCR在肝癌进展中可能发挥促进作用。

基质金属蛋白酶是存在于人体内的细胞外基质降解酶，其可以将细胞外基质降解而促进细胞的运动[9]。在肿瘤转移过程中，肿瘤细胞从原来的位置脱落，并随着血管或淋巴管进入新的组织和器官，通过恶性增殖形成转移灶[10]。肿瘤细胞合成的基质金属蛋白酶是肿瘤转移的基础[11]。MMP-2和MMP-9二者均是基质金属蛋白酶家族成员，也是目前发现的与肿瘤转移关系最为密切的基质金属蛋白酶[12]。实验表明，下调TINCR后的肝癌细胞侵袭和迁移能力下降，细胞中MMP-2和MMP-9蛋白表达水平也降低，提示TINCR在肝癌转移中可能发挥促进作用，靶向抑制TINCR可能是抑制肝癌恶性进展的途径。

现阶段对于lncRNA作用机制研究发现，lncRNA可以通过靶向调控下游基因的表达发挥不同的生物学作用，并且lncRNA在不同的组织以及病理进程中的靶向调控作用可能不同[13]。本次实验发现，TINCR靶向调控肝癌细胞系中miR-7的表达。miR-7是一个在肝癌组织中表达下调的miRNA分子，过表达miR-7可以抑制肝癌细胞系的侵袭和迁移[7]。本次实验发现，TINCR靶向调控肝癌细胞系中miR-7的表达，并且下调miR-7可以逆转下调TINCR对肝癌细胞侵袭和迁移的抑制作用，这充分证明下调TINCR抑制肝癌细胞侵袭和迁移与靶向调控miR-7有关。

总而言之，下调TINCR抑制肝癌细胞恶性增殖和转移潜能，其作用机制与靶向调控miR-7有关，目前对于其下游的具体调节机制还不清楚，靶向抑制TINCR表达可能是抑制肝癌进展和转移的有效途径。本实验结果为研究TINCR在肿瘤进展中的调控网络提供了参考，为明确肝癌分子发生机制奠定了基础。