超声辅助酶法提取海带岩藻黄素工艺条件研究

毕可海，张玉莹，孙玉奉，张伶俐，聂小伟，张玉清

（1.威海海洋职业学院食品工程系，山东威海264300；2.山东农业大学食品科学与工程学院，山东泰安271018）

岩藻黄素是一种天然的脂溶性色素，广泛存在于海带、硅藻等藻类和浮游植物中，其中海带中含量最高[1-2]。岩藻黄素因其结构中含有共轭双键、丙二稀和5，6-环氧烷结构[3]，因而具有较强的抗氧化能力，抗癌活性[4-10]，在国内外的医疗、保健行业被广泛关注。

海带是一种营养价值极高的褐藻。由于其富含碘、矿物质等被认为具有较高的食用和药用价值[11]。我国是海带生产大国，产量居世界首位[12]。海带是许多食品加工的原材料，如海带丝、海带挂面和海带复合调味素等[13-14]，但是我国关于海带的深加工技术相对单一，对于海带深加工主要集中在碘、褐藻胶以及甘露醇等附加值较低的产品[15]，而对于更富药用和食用价值的岩藻黄素的研究相对较少，因此本试验以海带为原料提取岩藻黄素。

目前关于岩藻黄素的提取方法较少，大多采用有机溶剂法，超声波辅助提取等传统工艺[16-17]，但是传统工艺由于无法破解细胞壁，因而不能有效的提取岩藻黄素。本试验用超声辅助生物酶对海带进行破壁处理，优化提取条件，使岩藻黄素可充分溶出，提取效率高，并且反应安全、无毒、可控。为海带岩藻黄素的提取和应用提供了理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

海带：市售；果胶酶（30 000 U/g）、纤维素酶（100 000 U/g）：上海研生生化试剂有限公司；石油醚、丙酮、甲醇、无水乙醇、氯仿等（均为分析纯）：天津永大化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

T6型紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；AR124CN电子天平：奥豪斯仪器（上海）有限公司；TG16-WS离心机：湖南湘仪离心机仪器有限公司；KQ-500DE超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 不同溶剂对海带岩藻黄素提取量的影响

分别称取海带粉末10 g置于烧杯中，向每个烧杯中分别加入200 mL不同提取溶剂[甲醇、乙醇、氯仿、丙酮、石油醚以及石油醚∶丙酮（1∶1，体积比）的混合溶剂]。将烧杯在50℃条件下水浴加热并搅拌，提取50 min后，抽滤出提取液，再次提取滤渣，合并提取液。悬蒸浓缩至10 mL，离心，去除杂质，取上清液。在450 nm波长下测定吸光度。

1.3.2 酶种类和超声辅助提取对海带岩藻黄素提取量的影响

准确称取10 g经粉碎磨粉后的海带粉末置于烧杯中，加入少量的超纯水，分别加入质量不同的果胶酶、纤维素酶、复合酶A[果胶酶∶纤维素酶（1∶1，质量比）]、复合酶 B[果胶酶 ∶纤维素酶（1 ∶2，质量比）]、复合酶 C[果胶酶 ∶纤维素酶（2∶1，质量比）]，另将盛有复合酶A的烧杯置于频率为70 W的超声中辅助酶解，在酶解pH值为6.0、温度为50℃的条件下，酶解60min后，加入石油醚∶丙酮（1∶1，体积比）的混合溶剂搅拌均匀后水浴提取1 h，离心，取上清液测定其吸光度值，计算岩藻黄素提取量。

1.3.3 酶解pH值对海带岩藻黄素提取量的影响

准确称取海带粉末置于烧杯中，分别调节pH值为 3.0、4.0、5.0、6.0，分别加入 4.0%的复合酶 A，在酶解温度为50℃的超声中酶解60 min后，加入石油醚∶丙酮（1∶1，体积比）的混合溶剂搅拌均匀后水浴提取1 h，离心，取上清液测定其吸光度值，计算岩藻黄素提取量。

1.3.4 酶解温度对海带岩藻黄素提取量的影响

准确称取海带粉末置于烧杯中，分别在酶解温度为 15、20、25、30、35、40、45、50、55、60 ℃，加入 4.0%的复合酶A，调节pH值为5.0，在超声中酶解60 min后，加入石油醚∶丙酮（1∶1，体积比）的混合溶剂搅拌均匀后水浴提取1 h，离心，取上清液测定其吸光度值，计算岩藻黄素提取量。

1.3.5 酶解时间对海带岩藻黄素提取量的影响

准确称取海带粉末置于烧杯中，分别调节酶解时间为 30、40、50、60、70、80、90 min，加入 4.0%的复合酶A，调节pH值为5.0，在温度为55℃的超声中酶解，加入石油醚∶丙酮（1∶1，体积比）的混合溶剂搅拌均匀后水浴提取1 h，离心，取上清液测定其吸光度值，计算岩藻黄素提取量。

1.3.6 响应面分析

以单因素试验结果为基础，利用响应面法中心组合设计（Box-Benhnken）进行试验设计。以酶解pH值、酶解时间（min）、酶解温度（℃）3个因素为研究对象，设计三因素三水平的试验，分析各因素对岩藻黄素提取量的影响，同时考虑各因素间的交互作用。经响应面分析后得到岩藻黄素的最大提取量和最优提取条件，并进行验证，响应面试验设计见表1。

表1 响应面试验设计Table 1 Coded and real levels of the independent variables used in the design

1.3.7 岩藻黄素含量的测定

岩藻黄素的提取量按下列公式[16]：

式中：A为449 nm下的吸光度值；V为样品的总体积，mL；A1%1cm为浓度溶质的理论吸收值（岩藻黄素为 1 600）。

1.4 数据处理

响应面试验的数据处理采用Design-Expert 8.05（b）软件。

2 结果与分析

2.1 不同溶剂对海带岩藻黄素提取量的影响

岩藻黄素是一种极性比较强的脂溶性色素，因此根据相似相容原理，岩藻黄素可能会易溶于极性较强的溶剂中，因此本试验选用甲醇、无水乙醇、氯仿、丙酮、石油醚以及石油醚和丙酮（1∶1，体积比）的混合溶剂等几种不同的溶剂作为提取溶剂。提取溶剂对岩藻黄素提取量的影响见图1。

图1 提取溶剂对岩藻黄素提取量的影响Fig.1 The effects of extraction solvent on the extraction amount of fucoxanthin

由图1可知，不同的提取溶剂对海带中岩藻黄素的提取量不同。其中岩藻黄素在石油醚和丙酮（1∶1，体积比）的混合溶剂中的提取量明显高于其他几种溶剂，说明石油醚和丙酮的混合溶剂更适合岩藻黄素的提取。因此选用石油醚和丙酮（1∶1，体积比）的混合溶剂作为岩藻黄素提取溶剂。

2.2 酶种类和超声辅助提取对海带岩藻黄素提取量的影响

酶种类和超声辅助提取对岩藻黄素提取量的影响见图2。

图2 酶种类和超声辅助提取对岩藻黄素提取量的影响Fig.2 The effects of enzyme types and ultrasound-assisted extraction on the extraction of fucoxanthin

由图2可知，在一定范围内，海带中的岩藻黄素提取量随着果胶酶和纤维素酶的添加而逐步提高，其中纤维素酶对岩藻黄素提取效果略微高于果胶酶的提取效果，之后增大酶的质量分数，由于底物的质量是一定的，因此不能使所有的酶与底物充分接触，从而抑制了酶的提取效果，因此岩藻黄素的提取量略有降低。而果胶酶和纤维素酶的复合，可以明显提高岩藻黄素的提取量，尤其是果胶酶和纤维素酶按质量比1∶1复合后，提取量最大，可达0.634 1 mg/g，这可能是因为海带细胞壁由果胶质和纤维素共同构成的[18]，使用复合酶后，对海带细胞壁起到更好的破壁效果，促进了岩藻黄素的溶出。而超声辅助可以明显提高岩藻黄素的提取效果，这可能是因为超声辅助可以促进岩藻黄素的溶出，因此本研究选用超声辅助复合酶（果胶酶：纤维素酶的质量比为1∶1）进行后续研究，这一结果与秦云等的结果相似[19]。

2.3 酶解pH值对海带岩藻黄素提取量的影响

酶解pH值对海带岩藻黄素提取量的影响见图3。

图3 酶解pH值对海带岩藻黄素提取量的影响Fig.3 The effects of enzymatic pH on the extraction amount of fucoxanthin

因果胶酶的作用pH值是在3.0～6.0之间，因此本试验选用酶解pH值为3.0～6.0。由图3可知，pH值对岩藻黄素的提取量的影响很大，当pH值为5.0时岩藻黄素提取量达到最大。这可能是因为pH值对酶的活力和催化效果影响较大，当pH值为5.0时，酶的活性得到充分发挥，催化效果最佳，细胞壁被充分破坏，使岩藻黄素可以充分溶出，因此提取量最大；而过高或过低的pH值，均会影响岩藻黄素的提取，这是因为在此pH值条件下，酶的活性无法被充分发挥，催化效果受到影响，从而影响了岩藻黄素的提取。所以，选择最佳酶解pH值为5.0。

2.4 酶解温度对海带岩藻黄素提取量的影响

酶解温度对海带岩藻黄素提取量的影响见图4。

由图4可知，在一定范围内，岩藻黄素的提取量随着酶解温度的上升而提高，当酶解温度达到55℃时，岩藻黄素的提取量达到最大，而随着酶解温度继续升高时，岩藻黄素的提取量下降。这是由于酶解温度过高会影响酶的活性，使酶的活性受到抑制，岩藻黄素的提取量降低。因此，本研究选用最佳的酶解温度为55℃。

图4 酶解温度对海带岩藻黄素提取量的影响Fig.4 The effects of enzymatic temperature on the extraction amount of fucoxanthin

2.5 酶解时间对海带岩藻黄素提取量的影响

酶解时间对海带岩藻黄素提取量的影响见图5。

图5 酶解时间对海带岩藻黄素提取量的影响Fig.5 The effects of enzymatic time on the extraction amount of fucoxanthin

由图5可知，在一定范围内岩藻黄素的提取量随着酶解时间的延长而增大，在酶解时间为70 min时达到最大，提取量可达0.836 6 mg/g，继续延长酶解时间，岩藻黄素的提取量反而下降，这可能是因为，岩藻黄素很容易被光照、空气氧化，稳定性较差[20-21]。试验中随着酶解时间延长，会导致岩藻黄素被氧化，因此导致岩藻黄素的提取量下降。因此，本研究选用70 min为最佳酶解时间。

2.6 响应面分析

2.6.1 模型的建立与显著性检验

通过处理试验数据，建立响应值（提取量）与3个因素间的回归模型（其中Y—岩藻黄素提取量，A—酶解pH值，B—酶解时间，C—酶解温度），得到的回归方程如下：

Y=-3.290 89+0.248 02A+0.065 039B+0.041 88C-2.750 00×10-4AB+7.500 00×10-4AC-1.350 00×10-5BC-0.026 462A2-4.438 75×10-4B2-3.815 00×10-4C2

三因素三水平响应面分析试验及岩藻黄素的提取量见表2。

回归模型变量方差分析见表3。

由表3可知，该模型的P值＜0.000 1，说明该数学模型可靠性较高；而失拟值P＞0.05，不显著，表明此模型上的数据充分拟合，试验不易受某些其他干扰因素的影响，可以有效避免较大的误差；岩藻黄素提取量的变异系数CV值为0.46，回归方程的相关系数R2为0.993 3，这表明预测误差较小，结果可靠，模型有较好的相关度；也说明回归方程可以较好地描述响应值与各因素间的关系，同时还可以预测实际的试验结果。

表2 三因素三水平响应面分析试验及岩藻黄素的提取量Table 2 Three factors and three levels esponse surface methods experimental and extraction amount of fucoxanthin

表3 回归模型变量方差分析Table 3 Analysis of variance of regression model

2.6.2 响应面的交互作用分析

响应面曲线图可以直观地反映各因素对提取量的影响，同时为研究各因素间的交互作用及确定岩藻黄素最大提取量和最适提取条件提供理论依据。岩藻黄素提取量的响应面图见图6。

图6 岩藻黄素提取量的响应面图Fig.6 The response surface map of fucoxanthin extraction

图6中可以直观地反映出在温度一定的条件下，酶解时间和酶解pH值对岩藻黄素提取量的影响。在一定范围内，岩藻黄素提取量随着时间的延长和pH值的增大而增大，同时观察等高线图可知，酶解时间对岩藻黄素的提取量影响更显著。而在时间一定的条件下，酶解温度和酶解pH值对岩藻黄素提取量的影响也很显著。随着酶解温度的升高和酶解pH值的增大，岩藻黄素的提取量也增大，且酶解温度对提取量的影响更为显著。在酶解pH值一定的条件下，酶解温度对岩藻黄素的提取量的影响较酶解时间更为显著。

综合来看，在影响岩藻黄素提取量的影响因素中，酶解温度对岩藻黄素提取量的影响最为显著，酶解时间次之。

2.6.3 回归模型验证

通过响应面分析模型及其对岩藻黄素最大提取量的预测，分析得出在酶解pH 5.14，酶解时间70.8 min，酶解温度为57.8℃，岩藻黄素提取量的预测值为0.838 2 mg/g。结合实际情况对预测条件和预测值进行修正，将酶解工艺修改为酶解pH 5.0，酶解时间为71 min，酶解温度为58℃。每组试验进行3次平行，结果见表4。

由表4可以看出，试验验证值与预测值的误差较小，这说明该数据是真实可靠的。

表4 验证试验结果Table 4 Results of the validation test

3 结论

本试验采用超声辅助酶法对海带中岩藻黄素进行提取，并优化不同酶种类、酶解pH值、酶解温度、酶解时间等提取条件。通过响应面优化条件，在酶解pH 5.0，酶解时间为71 min，酶解温度为58℃的条件下，岩藻黄素的提取量可达0.837 5 mg/g。海带是提取岩藻黄素的较为理想的原料，通过超声辅助酶法可以有效的将岩藻黄素提取出来，同时提取过程安全、无毒、可控性强，本试验为日后研究岩藻黄素的应用及功能开发提供基础。