Ki-67在肺非典型腺瘤样增生、原位腺癌、微浸润性腺癌及浸润性腺癌中的表达差异

胡文铧 吴爱兵 李媛媛 谢健龙 王永存▲

1.广东医科大学附属医院病理科，广东湛江 524000；2.广东医科大学附属医院肿瘤中心，广东湛江524000；3.广东省农垦中心医院肿瘤内科五区，广东湛江 524002；4.广东医科大学附属医院心胸外科，广东湛江524000

肺癌为当前临床中发生率最高的恶性肿瘤，我国每年约有1090万新确诊癌症，其中有135万例属于肺癌，而且病死率也居于癌症的首位[1]。其中，肺腺癌为肺癌常见的一种病理类型，主要是指来源于支气管黏膜上皮细胞的肺部癌灶。有研究指出[2]，肺腺癌患者即使病理分期、治疗手段相同，其复发率、转移率也会有显著的差异，而寻找此种差异出现的原因，能够有助于临床客观地判断患者的预后。因此，积极寻找独特的预后评估因子对于指导临床治疗具有重要的意义。细胞核相关抗原Ki-67是一种目前应用最广泛的增殖细胞标志物[3]。相关研究报道[4]，Ki-67作为一种核增殖抗原，其在肺癌中的研究有着广阔的前景，特别是在肺癌早期诊断、靶向治疗及其预后判断都有很高价值。现为进一步探讨Ki-67在肺不典型腺瘤样增生、原位腺癌、微浸润性腺癌、浸润性腺癌中的表达差异及其与临床病理因素的关系，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

按照2011年国际肺腺癌研究学会（International Association for the Study of Lung Cancer，IASLC）等公布的多学科肺腺癌新分类[5]，选取2010年1月～2019年1月广东医科大学附属医院、农垦中心医院确诊的93例癌前病变/肺腺癌患者进行研究，18例肺非典型腺瘤样增生患者中男9例，女9例，年龄51～85岁，平均（66.0±11.0）岁；25例原位腺癌患者中男12例，女13例，年龄49～82岁，平均（66.5±10.5）岁；22例微浸润性腺癌患者中男14例，女8例，年龄52～84岁，平均（67.0±10.0）岁；28例浸润性腺癌患者中男17例，女11例，年龄46～80岁，平均（66.0±11.0）岁，四种病理类型的年龄、性别资料比较无统计学差异（P＞0.05）。入组标准：（1）首次诊断，且经病理复检确诊；（2）临床资料齐全。排除标准：（1）既往有肺部手术史；（2）诊断不明；（3）纳入研究时伴有严重感染性疾病。

1.2 方法

1.2.1 试剂与仪器 DAB显色试剂（编号002941，美国Dako公司）；大鼠抗人Ki67单克隆抗体（货号 00006140，克 隆 号 MIB-1，Dako公 司）；Dako autostainer link48自动组织染色机购自丹麦Dako公司；OLYMPUS CX22双目显微镜。

1.2.2 标本采集 均在手术后取适量肺部病变组织作为实验标本，取材后将其置于10%中性福尔马林溶液中固定，并予以石蜡包埋，制作成厚度为4μm的连续切片。

1.2.3 检测方法 （1）根据1∶50比例配制好抗原修复液，置于全自动免疫组化预处理系统中进行预处理，将其加热到65℃，随后把切片置于抗原修复液中；（2）将抗原修复液加热到95℃，时间20min，随后降温至65℃，取出切片置于洗脱缓冲液浸泡5min；（3）将切片置于组织染色机上进行染色，并加入适量过氧化物酶阻断剂，5min后用洗脱缓冲液冲洗；（4）滴加一抗→二抗，并用洗脱缓冲液冲洗，然后用DAB显色剂显色→苏木素染色液复染；（5）将切片置于70%酒精→80%酒精→90%酒精→100%酒精→100%酒精中各2min，随后重复进行2次二甲苯透明5min，封片。在显微镜下观察、统计试验结果。与此同时，选择PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照。

1.2.4 结果判定[6]若细胞核内有棕黄色或深棕黄色颗粒可判断为阳性表达，每个标本切片在光镜高倍视野（×400）下选5个细胞增殖较为旺盛的视野计算阳性细胞数，每个视野的阳性细胞百分比=阳性表达细胞数量/总细胞数量×100%。

1.3 观察指标

（1）比较不典型腺瘤样增生、原位腺癌、微浸润腺癌、浸润性腺癌肺组织中Ki-67表达差异；（2）比较不同分化程度、侵袭转移、淋巴结转移程度中Ki-67表达差异。

1.4 统计学方法

应用SPSS19.0统计学软件，采用χ2检验，计量资料Ki-67表达水平的统计描述采用（）表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较应用方差分析，两两比较比较采用LSD-t检验。相关性分析采用Spearman相关性分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同病理类型Ki-67表达水平差异

Ki-67在肺非典型腺瘤样增生、原位腺癌、微浸润性腺癌及浸润性腺癌中的表达水平逐渐升高，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 不同病理类型Ki-67表达水平差异

2.2 肺浸润性腺癌中Ki-67表达与相关临床病理因素的关系

本研究28例肺浸润性腺癌患者中，不同组织学分级之间的Ki-67表达水平差异有统计学意义（P＜0.05），但Ki-67表达在有无淋巴结转移、肿瘤侵袭转移不同程度中的比较，差异无统计学意义（P＞ 0.05），见表2。而且经Spearman相关性分析，Ki-67表达与淋巴结转移与否、侵袭转移程度均无相关性（r=0.052，P=0.792；r=0.098，P=0.542），但与组织学分级呈显著的负相关（r=-0.527，P=0.004）。

表2 肺浸润性腺癌中Ki-67表达与相关临床病理因素的关系

3 讨论

随着空气环境污染的加重以及吸烟人数的逐年升高，肺癌成为我国第一大癌症，而且由于肺癌的早期表现不明显，在临床首次确诊病例中有80%已发展为晚期[7]。目前，肺腺癌发病率不断攀升，已经超过肺鳞状细胞癌，肺腺癌的精准化治疗越发重要，而精准化治疗的坚强后盾即需精准化的病理诊断。其中，Ki-67为当前临床中较为常用的一项肿瘤检测指标，有学者[8-9]认为，按照WHO提出的肺腺癌多学科分类的内容和新标准，探讨Ki-67在肺腺癌组织中的表达情况及相关性有助于临床更清楚地了解肺腺癌的生物学行为，进而为疾病诊治以及预后评估提供相关参考依据。

Ki-67最早是在霍奇金淋巴瘤小鼠的免疫系统中发现的，将其纳入到单克隆抗体范畴。而随着对其研究的不断深入，发现Ki-67的分子结构由分子量分别为395KD、345KD的两条多肽链所组成，属于一种与细胞增殖密切相关的核蛋白，且其生物功能与RNA转录有关，故有学者[10]提出，Ki-67活性降低可以抑制核糖核酸RNA合成。近年，Ki-67蛋白活性已成为各种恶性肿瘤研究的热门生物指标之一，主要是通过检测病变组织Ki-67阳性表达水平来了解其癌细胞增殖活性[11]。当前临床，免疫组化检测方法是了解Ki-67蛋白表达情况继而用以评估癌细胞增殖程度最可靠的手段[12]。牛聪等[13]采用免疫组化手段对比肺癌组织、癌旁组织、肺部良性病变组织中Ki-67阳性表达情况，结果发现肺癌组织的Ki-67样本表达显著升高。张连美等[14]研究也显示，非小细胞肺癌组织的Ki-67阳性表达率较癌旁组织要高，且表达高低与淋巴结转移、TNM临床分期密切相关，而与癌灶大小、位置等无相关性。本研究结果也发现，Ki-67在非典型腺瘤样增生、原位腺癌、微浸润性腺癌及浸润性腺癌组织中的表达水平逐渐升高，提示Ki-67高表达时能够导致肿瘤细胞异常增殖。此外，本研究还发现，Ki-67表达水平与组织学分级有显著的相关性（P＜0.05），但与淋巴结转移、肿瘤侵袭转移无明显的相关性（P＞0.05），提示Ki-67表达与肺腺癌的增值生长程度有着正相关性，故检测该指标有助于辅助预测肺腺癌的生物学行为，为患者的预后判断提供参考依据。但本研究结果与韩义明等[15]研究不同，其提出Ki-67表达与肺腺癌肿瘤细胞的生长、侵袭转移及淋巴结转移呈正相关，笔者推测这有可能与样本量大小、地区差异等有关。

综上所述，Ki-67高表达为肺腺癌发生的主要分子事件，可参与肿瘤发展，但具体机制仍有待进行大样本、多中心、多因素分析。