四妙勇安汤对动脉粥样硬化模型兔自噬相关因子的影响

于红红，唐 飞，喻旭梅，俞 琦，李 芳，许 滔，田维毅

(贵州中医药大学，贵州 贵阳 550002)

动脉粥样硬化(Atherosclerosis，AS)是以血管壁产生粥样斑块、动脉管壁内膜增厚等为其主要特征，是诸多心脑血管疾病的基本病理基础[1]。四妙勇安汤载于《验方新编》，由金银花、玄参、当归、甘草组成，具有清热解毒、活血通脉的功效。药理研究发现，四妙勇安汤具有抗炎、抗氧化、保护血管内皮细胞、降脂等作用[2-5]。研究资料显示，细胞自噬与AS密切相关，参与并调控着AS发生发展的进程[6]。适度的自噬能起到抑制AS形成和进展的作用[7]。本实验通过构建新西兰兔AS模型，观察四妙勇安汤对其血脂指标和自噬相关因子中Atg5、Beclin1、mTOR mRNA表达的影响，探讨其抗AS的部分调控机制，为四妙勇安汤防治AS积累相关实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康新西兰兔36只，雄性，8周龄，体重(2.5±0.3)kg，购自长沙市天勤生物技术有限公司，动物许可证号SCXK(湘) 2014-0011，购自饲养于相对温度(23±2)℃，相对湿度(50±10)%的环境中，饲养管理均严格按照实验动物的要求及规则。

1.2 药物与试剂

四妙勇安汤按《验方新编》原方配伍比例(金银花90 g、玄参90 g、当归60 g、甘草30 g)组方，购自北京同仁堂贵阳店，并经生药实验室专家鉴定为正品。按照常规方法煎煮制备水煎液[8]，4℃保存，每次制备后一周内使用。总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL-C)、高密度脂蛋白(HDL-C)测定试剂盒(四川迈新生物技术有限公司)；Trizol(美国 Invitrogen公司)；逆转录试剂盒、Taq酶(Takara公司)；苏木素染色液(北京索莱宝科技有限公司)；辛伐他汀片(浙江海正药业股份有限公司)；PCR反应引物由上海生工生物技术有限公司合成。

1.3 制备家兔AS模型

适应性喂养1周后开始造模。新西兰兔30只给予含脂肪2l%、胆固醇0.15%的“西方类型膳食”照射灭菌高脂饲料；6只新西兰兔给予照射灭菌的普通饲料喂养。分别喂养12周。

1.4 动物分组及干预方法

普通饲料喂养的新西兰兔为正常对照组，将AS模型家兔随机分成模型组、四妙勇安汤小、中、大剂量组(9 g/kg/d、18 g/kg/d、36 g/kg/d)和辛伐他汀组(3 mg/ kg/d)，每组6只，造模12周后灌胃给药6周，每日1次。空白组和模型组给予等体积生理盐水灌胃。

1.5 血脂检测

于末次给药后禁食不禁水12 h，次晨将其麻醉后取血约5 mL，室温静置30 min后，3 000 r/min离心15 min，分离并收集血清。按TG、TC、LDL-C、HDL-C的生化试剂盒说明书，使用全自动生化分析仪检测各组的TG、TC、LDL-C、HDL-C含量。

1.6 HE染色观察斑块情况

小心取出已麻醉取血过的新西兰兔主动脉，将主动脉周围的脂肪组织和结缔组织剥离干净，并剪取部分主动脉根部，进行常规石蜡和OCT包埋，HE染色观察斑块情况。

1.7 实时荧光定量PCR检测Atg5、Beclin1、mTOR mRNA的表达

取兔主动脉匀浆组织，应用Trizol提取总RNA，并逆转录合成cDNA。用实时荧光定量PCR仪进行扩增，检测各目的基因，采用2-△△Ct方法对实验结果进行分析计算其表达量。PCR反应扩增条件为：95℃变性4 min；95 ℃ 30 s，循环1次；95 ℃ 5 s，55 ℃ 10 s，40个循环；72 ℃延伸5 min。以GAPDH为内参。引物序列：Atg5上游：5′-ATGACAG ATGACAAAGATGTG-3′，下游：5′-TGTGCCTTCATATTCAAACC-3′；Beclin1 上游：5′-CCGCAAGATAGTGGCAGAA-3′，下游：5′-CGACCCAGCCTGAAGTTAT -3′；mTOR 上游：5′-CTGGGACTCAAATGTGTGCAGTTC- 3′，下游：5′-GAACAA TAGGGTGAATGATCCGGG-3′；GAPDH上游：5′-AGGTCGGTGTGAACGGAT TTG-3′，下游：5′-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3′。

1.8 统计分析

2 实验结果

2.1 HE染色观察斑块情况

光学显微镜下HE染色可见：正常对照组主动脉内膜光滑，管壁厚度均匀，泡沫细胞和斑块的形成均不明显；与正常对照组相比，模型组主动脉斑块面积增大，主动脉血管壁增厚且厚薄不一，可见泡沫细胞形成的动脉粥样硬化斑块；与模型组相比，四妙勇安汤各剂量组及辛伐他汀组家兔主动脉血管泡沫化程度减轻，斑块面积明显减少。

2.2 对AS兔血脂的影响

与正常对照组相比，模型组家兔血清中TG、TC、LDL-C水平显著升高，HDL-C水平显著降低(P<0.01)。与模型组相比，四妙勇安汤各剂量组和辛伐他汀组均能下调TG、TC、LDL-C水平，上调HDL-C水平(P<0.05或P<0.01)。结果见表1。

表1 四妙勇安汤对 AS兔血脂水平的影响

2.3 对AS兔自噬因子Atg5、Beclin1和mTOR mRNA表达的影响

与正常对照组相比，模型组主动脉中 Atg5、Beclin1 mRNA表达均显著上升，mTOR mRNA的表达显著下降(P<0.01)。与模型组相比，四妙勇安汤各剂量组及辛伐他汀组干预后主动脉Atg5及Beclin1 mRNA表达水平上调，而mTOR mRNA的表达受到明显抑制(P<0.05或P<0.01)。结果见表2。

表2 四妙勇安汤对Atg5、Beclin1和mTOR mRNA表达的影响

3 讨论

细胞自噬是受多种基因调控的细胞主动性“自食”过程，不仅维持细胞分化、能量稳态，还在器官发育、炎症及免疫调节方面发挥着重要的作用[9]。资料显示，在AS发生发展的不同阶段均存在自噬活性改变，基础水平的自噬对AS具有保护作用，能抑制AS的发展进程。Atg5是参与调控自噬的重要基因，在自噬调控中扮演重要角色，其表达强度与自噬活性成正相关[10]。Beclin1是酵母自噬基因Atg6在哺乳细胞中的同源蛋白，参与自噬体的形成，其表达强度与自噬活性紧密相关[11]。mTOR是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在转录和自噬体形成水平诱导自噬，在自噬的调控过程中扮演着负性调控的角色[12]。

在本实验中，血脂检测结果显示四妙勇安汤各剂量及辛伐他汀组均能下调TG、TC、LDL-C水平，升高HDL-C水平；PCR结果显示四妙勇安汤各剂量及辛伐他汀组均能诱导Atg5 mRNA和Beclin1 mRNA的表达，抑制mTOR mRNA的表达，且部分干预作用呈现出剂量依赖性。四妙勇安汤可诱导AS家兔自噬相关基因Atg5、Beclin1的表达，抑制mTOR的表达，这可能是该方抗AS作用的重要机制之一。