miR-425通过靶向PTPRN2调节肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭

陈宁 牛垚飞 佑航标 占伟丽 吴贺文

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)的发病率和病死率呈逐年上升趋势[1]，但其发病机制尚未完全明确。已有研究报道miR-425在多种癌细胞中表达水平明显升高，可促进癌细胞的增殖、迁移和侵袭[2,3]。本研究旨在探讨miR-425对肝癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响及其作用机制。

资料与方法

一、实验材料

(一)细胞株 人肝癌细胞系(MHCC-97H、SMMC-7721)和正常肝细胞系HL-7702由复旦大学中山医院肝癌研究所提供，人肝癌细胞系HepG2购自中国科学院上海细胞库。所有细胞株生长在含10%胎牛血清、青霉素(100 U/mL)和链霉素(100 mg/mL)的DMEM培养基中，置于37℃、体积分数为0.05的CO2的细胞培养箱中培养。

(二)主要试剂 DMEM培养基和胎牛血清购自赛默飞世尔科技公司；转染试剂LipofectamineTM 2000购自美国Invitrogen公司；RNA提取试剂盒和实时荧光定量PCR试剂盒SYBR Premix Ex TaqTM购自大连Takara公司；miR-425 mimic、miR-425 inhibitor、阴性对照(NC)、干扰PTPRN2表达的质粒(si-PTPRN2)和对照质粒(si-NC)由上海吉玛生物公司合成；Transwell小室和基质胶购自美国BD公司；荧光素酶检测试剂盒来源于美国Promega公司；实验所需的一抗和二抗购自美国Abcam公司。

二、实验方法

(一)实时荧光定量PCR检测miR-425 利用RNA提取试剂盒提取细胞中总RNA，然后反转录为cDNA，使用SYBR Premix Ex TaqTM试剂盒按照说明书进行PCR。miR-425和内参U6的引物由上海吉玛生物公司设计并合成。反应条件：95 ℃预变性10 min，95 ℃变性10 s、60 ℃退火20 s、70 ℃延伸10 s共40个循环，获得Ct值，利用公式2-ΔΔCt计算相对表达量。

(二)MTT实验 将转染成功的对数期细胞使用胰酶消化后，制成单细胞悬浮液并以每孔1000个细胞数接种到96孔板中，置于37 ℃、体积分数为0.05的CO2细胞培养箱中培养。分别培养24、48和72 h，每孔加入20 μL MTT并充分混匀，继续培养4 h。然后缓慢吸去孔内培养液，每孔加入二甲基亚砜(DMSO)150 μL，待结晶物质充分溶解后，以空白孔调零，在Bioteck DR-3506全自动酶标仪上测定波长为490 nm的吸光度(A)值。

(三)Transwell迁移和侵袭实验 首先将转染后第2天的肝癌细胞用无血清的DMEM培养基制备成1×106个/ml的细胞悬液，然后在24孔板中加入含10%胎牛血清的DMEM培养基1 mL，将Transwell小室放在孔上，吸取200 μL细胞悬液分别加入小室(迁移实验)和铺有基质胶的小室(侵袭实验)中。两种实验的每组均设置3个复孔，置于37℃、体积分数为0.05的CO2细胞培养箱中继续培养24 h，用棉签轻轻地除去小室内侧的细胞。用95%乙醇固定20 min后，用0.5%结晶紫溶液对小室底部细胞进行染色，于倒置显微镜下观察、拍照并计数。

(四)双荧光素酶实验 首先将肝癌细胞HepG2接种于24孔板中，分3组：野生型质粒组、突变型质粒组和对照组，分别共转染miR-425 mimic和野生型质粒pGL3-PTPRN2 3′UTR Wt，共转染miR-425 mimic和突变型质粒pGL3-PTPRN2 3′UTR Mut，共转染miR-425 mimic和对照荧光素酶质粒。转染48 h后制备裂解物，利用双荧光素酶报告基因测定系统(Applied Biosystems)进行荧光活性检测，以海肾荧光素光吸收值作为内参，独立重复实验3次。

(五)蛋白质印迹实验 利用磷酸盐缓冲液清洗待测肝癌细胞3次，加入细胞裂解液(含有蛋白酶抑制剂)提取细胞中的总蛋白，100℃ 5 min进行变性。用12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离并转至硝酸纤维素膜上，5%脱脂牛奶封闭1 h，加入PTPRN2一抗(1∶1 000)、内参GAPDH一抗(1∶2 000)，4℃孵育过夜，次日加入辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶5 000)孵育2 h，TBST充分清洗后加入发光液，最后利用凝胶成像仪进行曝光、拍照并测定灰度值计算目的蛋白的表达水平。

三、统计学分析

利用SPSS 17.0软件进行统计学分析，正态分布的计量数据以均数±标准差表示，两组比较采用t检验，多组比较采用单因素方差分析，P<0.05表示差异有统计学意义。

结 果

一、miR-425在肝癌细胞系中的表达情况

miR-425在正常肝细胞系HL-7702及不同肝癌细胞系HepG2、SMMC-7721、MHCC-97H中的表达量分别为：1.00±0.03、2.01±0.13、3.97±0.24、9.14±0.26。与正常肝细胞相比，miR-425在肝癌细胞中的表达水平明显升高，差异均有统计学意义(均P<0.05)。

二、封闭miR-425抑制肝癌细胞的增殖

与转染阴性质粒的MHCC-97H细胞相比，miR-425的表达水平在转染miR-425 inhibitor组细胞中显著下降(1.05±0.08比0.28±0.03)，差异有统计学意义(P<0.01)。结果表明，miR-425 inhibitor可明显降低MHCC-97H细胞中miR-425的表达。随后利用MTT实验检测miR-425对肝癌细胞增殖情况的影响。如图1所示，与NC组相比，miR-425 inhibitor组细胞的生长速度明显减慢；培养72 h后MHCC-97H细胞的增殖能力显著低于对照组(P<0.05)。由此可见，封闭miR-425的表达可明显抑制肝癌细胞的增殖。

图1 miR-425对肝癌细胞增殖的影响

三、封闭miR-425抑制肝癌细胞的迁移和侵袭

利用Transwell迁移和侵袭实验检测miR-425对肝癌细胞MHCC-97H迁移和侵袭能力的影响。如图2A所示，miR-425 inhibitor组迁移细胞数比NC组显著减少(45±5比118±10，P<0.01)。如图2B所示，miR-425 inhibitor组侵袭细胞数明显少于NC组(32±5比94±8，P<0.01)。由此可见，封闭miR-425可明显抑制肝癌细胞的迁移和侵袭能力。

图2 miR-425对肝癌细胞迁移和侵袭的影响

四、双荧光素酶实验验证miR-425与PTPRN2的靶向关系

生物信息学预测miR-425种子序列可与PTPRN2 3′端非翻译区(3′UTR)配对结合，然后利用双荧光素酶实验验证二者之间的靶向关系。与对照组相比，共转染miR-425 mimic和PTPRN2 3′UTR野生型质粒细胞的荧光素酶活性明显降低(0.99±0.09比0.40±0.03，P<0.05)；而共转染miR-425 mimic和PTPRN2 3′UTR突变型质粒细胞的荧光素酶活性无明显变化(1.00±0.05比0.93±0.07，P>0.05)。如图3所示，与对照组相比，miR-425 mimic组MHCC-97H细胞中PTPRN2蛋白表达水平明显下降(P<0.05)。由此可见，miR-425可直接靶向结合PTPRN2并下调其蛋白表达水平。

图3 miR-425对PTPRN2蛋白表达水平的影响

五、miR-425通过靶向PTPRN2影响肝癌细胞的增殖能力

封闭miR-425的表达后肝癌细胞MHCC-97H的增殖水平明显受抑制，随后在miR-425 inhibitor 组细胞中沉默PTPRN2蛋白表达，利用MTT实验检测细胞的增殖水平是否可被逆转。如图4所示，miR-425 inhibitor+si-NC组MHCC-97H细胞的增殖能力明显低于NC+si-NC组(P<0.05)；与miR-425 inhibitor+si-NC组相比，miR-425 inhibitor+si-PTPRN2组MHCC-97H细胞的增殖能力明显升高(P<0.01)。结果表明，miR-425通过靶向下调PTPRN2的表达水平促进肝癌细胞的增殖。

图4 miR-425通过靶向PTPRN2影响肝癌细胞的增殖

六、miR-425通过靶向PTPRN2影响肝癌细胞的迁移和侵袭能力

封闭miR-425的表达后肝癌细胞MHCC-97H的迁移和侵袭能力明显受抑制，随后在miR-425 inhibitor 组细胞中沉默PTPRN2蛋白表达，利用Transwell迁移和侵袭实验检测细胞的迁移和侵袭能力是否可被逆转。如表1所示，miR-425 inhibitor+si-NC组迁移和侵袭肝癌细胞数均明显低于NC+si-NC组(均P<0.01)，与图2结果一致；与miR-425 inhibitor+si-NC组相比，miR-425 inhibitor+si-PTPRN2组迁移和侵袭肝癌细胞数均明显增高(均P<0.01)。结果表明，miR-425通过靶向下调PTPRN2的表达水平促进肝癌细胞的迁移和侵袭。

表1 miR-425通过靶向PTPRN2影响肝癌细胞的迁移和侵袭(±s，n=6)

讨 论

越来越多的研究表明，肝癌组织和细胞系中多种miRNA表达失调，通过调控某些癌基因或抑癌基因的表达水平，参与肝癌的发生发展进程[4-5]。研究发现miR-122a在肝癌组织和细胞系中均表达下调，通过靶向抑制细胞周期蛋白cyclinG1的表达可使肝癌细胞阻滞于S期[6]。Meng等[7]研究证实，miR-21在肝癌组织中明显高表达，可通过靶向下调抑癌基因PTEN的蛋白表达促进肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭过程。Lin等[8]研究报道，在肝癌细胞系中miR-122的表达显著下调，miR-122可抑制凋亡相关Bcl-2家族成员Bcl-w的蛋白表达，间接激活caspase-3从而促进肝癌细胞凋亡。

本研究发现，miR-425在肝癌细胞系中的表达水平显著高于正常肝细胞；抑制miR-425 表达后，肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力均明显受到抑制。随后，对于miR-425作用的靶基因及其发挥介导肝癌细胞生长、迁移和侵袭功能进行进一步的研究。首先利用生物信息学软件TargetScan和miRanda对miR-425作用的可能靶基因进行预测分析，结合基因的已知功能，最终筛选出受体型蛋白酪氨酸磷酸酶N2(receptor-type tyrosine-protein phosphatase N2，PTPRN2)为其候选靶基因并作为进一步研究的对象。

蛋白质酪氨酸磷酸酶参与细胞的信号转导，调节细胞生长、分化、代谢、基因转录和免疫应答，在调控肿瘤生长过程中发挥重要作用[9]。已有研究表明， PTPRN2是蛋白酪氨酸磷酸酶家族中的成员，在肺癌、乳腺癌、神经胶质瘤等多种肿瘤呈现异常表达[10]，并与细胞凋亡存在密切联系[11]。近年来有研究表明，PTPRN2可抑制肿瘤细胞的增殖和活力，发挥抑癌基因作用[12]。本研究表明，在肝癌细胞MHCC-97H中，miR-425可直接靶向作用于PTPRN2并负调控其蛋白表达。在肝癌细胞MHCC-97H中，利用小干扰RNA技术沉默PTPRN2蛋白表达后再次进行细胞学功能实验，结果发现抑制PTPRN2蛋白表达后，可逆转封闭miR-425表达后的作用，使肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力均明显升高。