人工培养粉被虫草菌丝体和孢梗束的代谢组差异

何亚琼，尹春林，朱 梦，谢少康，胡丰林

(1.皖北卫生职业学院，安徽 宿州 234000；2.安徽农业大学，安徽 合肥 230036)

粉被虫草(Cordyceps pruinosa Petch)，属于子囊菌纲，肉座目，麦角科，虫草属，其无性型为马利亚霉新种(Mariannaea pruinosa Liang sp.nov.)[1]。粉被虫草具有抗紫外线辐射、抑制细菌、免疫调节、抗癌和抗炎等生物学活性[2-7]，利用NMR和气质联用(GC-MS)对不同培养基和光照条件培养下的粉被虫草代谢组进行分析，共鉴定了5种醇、21种氨基酸、15种有机酸、4种嘌呤、3种嘧啶、7种糖、11种脂肪酸和5种其他代谢物[8]，可见将其作为保健品，具有良好的开发前景。代谢组学可分析生物体内所有代谢物，通过生物信息化学、计量学和统计学分析，发掘其内在联系，研究生物体系的代谢过程及代谢途径[9]。本研究采用基于HPLC-TOF-MS代谢组分析技术，比较人工培育的粉被虫草菌丝体和孢梗束代谢差异，为后期的合理开发建立理论基础。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂Agilent 6210飞行时间高分辨液质联用分析仪，购于美国Agilent公司；分析型色谱柱Agilent poroshell 120 EC-C18(2.7μm，3.0mm×100mm)，购于美国waters公司；电子天平(JA5103N)，购于上海民桥精密科学仪器公司；FreeZone12冷冻干燥系统，购于美国Labonconco公司；离心真空浓缩仪(RVC 2-25)，购于德国Christ公司；数控超声波清洗器(JK-300DB)，购于合肥金尼克机械制造有限公司；全温振荡培养箱(ZQZY-70CF)，购于上海知楚仪器有限公司；光照培养箱(DHP-90)上海一恒科学仪器有限责任公司。HPLC级甲酸、甲醇和乙腈，都购于Thermo Fisher Scientific公司；纯化水，购于屈臣氏集团有限公司。

1.2 菌株和培养粉被虫草无性型-粉被马利娅霉Mp09来自安徽农业大学微生物防治重点实验室。

菌种培养：在超净工作台，用接种针挑取适量菌接种于SDAY培养基中(葡萄糖40g/L，蛋白胨10g/L，酵母浸出粉10g/L，琼脂20g/L)，25℃培养7d。

液体培养：挑取适当的菌种培养物接入SDY培养基(葡萄糖40g/L，蛋白胨10g/L，酵母浸出粉10g/L)，25℃，150r/min培养3d。

固体培养：取10mL液体培养物转接到糙米培养基(20g糙米加入40mL营养液，营养液：马铃薯200g/L、葡萄糖10g/L、麦芽糖10g/L、酵母份10g/L、蛋白胨10g/L、无水硫酸镁1.5g/L、磷酸二氢钾3g/L、柠檬酸三铵0.4g/L、复合维生素B4粒/L)，25℃黑暗培养，直到菌丝长满培养基表面，然后全光照培养45d。培养7d时取其菌丝体备用，培养45d时取其孢梗束备用。

1.3 样品处理将固体培养7d的菌丝体和45d的孢梗束分别刮入5mL离心管，放入液氮中冷冻，置于-80℃保存。菌丝和孢梗束冻干48h后，用粉碎机粉碎。分别称取30mg冻干的菌丝和孢梗束，各加入3mL提取液(V氯仿∶V甲醇∶V水=1∶2.5∶1)和30μL内标Fmoc-glycine(1mg/mL)，超声提取1h后4℃静置12h。提取物1×104r/min离心10min，取2.8mL上清，真空浓缩干燥，置-80℃保存。HPLC-MS分析前用400μL 90%甲醇超声复溶并经0.22m滤膜过滤。以上样品各做五个生物学重复。

1.4 HPLC-MS分析色谱条件：进样体积2μL，柱温40℃，流速0.3mL/min，流动相：A=0.1%甲酸的水溶液，B=0.1%甲酸的乙腈，洗脱梯度：0～3min，3%B；3～50min，3～100%B；50～60min，100%B。

质谱条件：干燥气为N2，温度350℃，流速12L/min，雾化气压35psi；毛细管电压：阳离子模式4000V，阴离子模式3500V；碎裂电压：阳离子模式215V，阴离子模式175V，锥孔电压60V；质量采集范围：阳离子模式80～1000Da，阴离子模式80～1100Da。

1.5 代谢物识别代谢物识别依据：(1)基于化合物质谱特征、精确质荷比及同位素模式识别计算分子式。该分子式与本实验室积累的昆虫病原真菌天然产物数据库和网络数据库[Dictionary of Natural Products(DNP)、METLIN等]搜索匹配，确定差异化合物；(2)用代谢的质量碎片与METLIN和MASSBANK中相同的或具有类似结构的化合物的质谱比对；(3)通过代谢物极性与其结构性质进行验证；(4)查阅虫生真菌代谢物文献验证。

1.6 数据处理原始HPLC-MS数据通过MassHunter software中的Molecular Feature Extraction运算进行自动峰检测、色谱去卷积和去除信噪比小于5的杂质峰等处理，最后导出每个样品的峰列表。导出的数据上传至MetaboAnalyst进行峰对齐、归一化等处理。使用SIMCA14.1进行PCA和OPLS-DA分析，使用MetaboAnalyst进行t-test和one-way ANOVA分析。

2 结果与分析

2.1 主成分分析主成分分析(Principal component analysis，PCA)是将质谱分析所得的多维数据降低到一个二维空间，视觉直观了解粉被虫草菌丝体和孢梗束代谢物差异的整体情况。阳离子模式(R2X=0.939，Q2=0.824)和阴离子模式(R2X=0.802，Q2=0.547)，数据均大于0.5，说明阴阳离子模式下，模型构建较好。图1为HPLC-MS阴、阳离子模式下粉被虫草菌丝体组(JST)和孢梗束组(BGS)化合物差异的PCA-2D得分图。其中A为总阴离子模式，前2个主成分可以对80.2%的变量进行解释，其中PC1=67.8%，PC2=12.4%；B为总的阳离子模式，前2个主成分可以对90.76%的变量进行解释，其中PC1=86%，PC2=4.76%。从图1可以看出，JST和BGS的积分矩阵图可完全分离，说明JST和BGS之间代谢物存在明显差异。

2.2 正交偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA)由于PCA是一种没有监督的分组方法，当对样品分组时出现分组内部之间的差异大于组与组之间的差异时，这种分组方式就变得不够清晰，此时，采用一种有监督的分析方法十分必要。OPLS-DA是一种通过去除与分组无关的系统自身差异来筛选出代谢差异物，从而能够使分离达到最大化[10]。OPLS-DA使用中，要求R2X≥0.5，R2Y≥0.5，Q2≥0.5；于此同时，还需要对PLS-DA进行排列检验，使用与OPLS-DA实验具有相同个数的成分(permutations，n=200)，当截距Q2≤0.05，满足上述条件表示该模型预测能力较好。S-plot主要用来获得OPLS-DA分组后的样品之间代谢差异物，其中P[1]≥|0.05|，P(corr)≥|0.5|；并且对所得结果经过t-test，其中P<0.05的变量被认为是和分组相关的显著性差异物[11]。

本文采用BGS和JST两相比较方式进行分析，见图2。所有模型中R2X≥0.5，R2Y≥0.5，Q2≥0.5；排列检验中截距Q2≤0.05，则认为这些模型未出现过拟合，较为可靠，可以进行数据分析。

OPLS-DA的得分图显示JST和BGS在OPLS1上可以明显分开，两组间的差异代谢物通过S-plot(a、b)识别，阴、阳离子模式下共识别58个差异化合物，具体详情见表1。

表1 BGS和JST在阴离子和阳离子模式下识别的显著性差异物

JST中含量较高的化合物主要有磷脂类物质如PC(18∶0/0∶0)、PC(16∶0/0∶0)、PC(18∶1/0∶0)、PC(18∶2/0∶0)、PC(17∶2/0∶0)、PS(21∶1/0∶0)、PS(21∶0/0∶0)、PE(18∶1/0∶0)和Linoleylglycerol phosphate ethanolamine；鞘氨醇及其衍生物如militarinone C和phytosphingosine；肽类和氨基酸衍生物如allobeauvericin B、allobeauvericin C、Nα-dimethylcoprogen、Nα-dimethylcoprogen N-oxide、ferricrocin、schizokinen和citrifelin B；糖类物质如D-glucopyranosyl-L-rhamnosel和4-O-Glucopyranosyl-D-gluconic acid，以及脂肪酸类物质如hydroxy palmitic acid、palmitic acid、Linoleic acidh和8-oxo-9-octadecenoic acid等。相对JST，BGS中检测到更多具有生物活性的次生代谢产物，如生物碱类、核苷类、萜类、酮类、酸酐等等。其中生物碱类化合物有daunomycin、ethoheptazine citrate、OPC、amino-eicosanediol和octadecenoic acid-2-amino-2-methyl-1-propanol；核苷类有N6-(2-Hydroxyethyl)adenosine、decarboxydihydrocitrinone和adenine；萜类物质有Austalide N；酮类化合物有cycloartobilxanthone和decahydroxy-biisoflavone；酸酐类化合物有ceramidastin等。

通过OPLS-DA中的S-plot图获得JST与BGS间的差异代谢物，这些差异代谢物主要包括磷脂类、肽类、糖类、脂肪酸、生物碱类、核苷类、糖苷类、酮类和鞘氨醇及其衍生物。

3 讨论

基于液质联用的代谢组学分析结果显示：人工培养的粉被虫草菌丝体和孢梗束代谢组差异显著。二者具有不同的代谢谱，粉被虫草菌丝体代谢物中有31个代谢物，其含量显著高于孢梗束，其中磷脂类、肽类、氨基酸、脂肪酸和糖类等营养物质较多，因此菌丝可能具有较高营养价值。孢梗束中有27个代谢物含量较高，包括生物碱类、核苷类、萜类、酮类、酸酐等活性物质，其中HEA、cycloartobilxanthone、ceramidastin等化合物具有抗紫外辐射、治疗慢性肾间质纤维化和糖尿病性肾病、抑制肺癌细胞迁移和治疗细菌性皮炎等活性，可见孢梗束具有较大的药用价值。

磷脂酰胆碱和鞘酯等化合物是重要营养和保健物质[12-16]，该类物质在菌丝中含量较高，表明菌丝可能具有较高营养价值。菌丝中含量高的肽类化合物大多是铁载体。铁不仅是许多酶的辅助因子，还是电子运输系统中的催化剂，参与氧的运输、DNA的合成和电子转移过程等代谢过程，参与细胞铁积累与菌丝体着色[17-18]；研究还显示氧化胁迫可导致Aspergillus nidulans细胞内铁载体Ferricrocin的积累[18]。菌丝中铁载体含量的增加说明菌丝在生长过程中可能受到了氧化胁迫，同时由于本研究培养基中没有添加铁试剂，可能导致菌体铁元素不足，从而刺激菌体的营养吸收器官(菌丝)合成更多铁载体，以提高铁吸收能力，提示在以后的培养中可适当添加铁试剂。

孢梗束中Daunomycin于1963年首次从S.peucetius中发现一种蒽环类抗生素，该化合物具有抗细菌、肿瘤和病毒活性[19]。N6-(2-Hydroxyethyl)adenosine(HEA)，又名茧草菌素，该化合物于1983年从粉被虫草在内的17种虫草菌丝体和6种棒束孢的水‐乙醇提取物中检测到。早期研究显示HEA具有较强的钙离子拮抗、正性肌力和抗紫外辐射活性[20-21]。近年研究发现HEA还具有较强的抗炎和抗氧化活性，在治疗慢性肾间质纤维化和糖尿病性肾病方面具有较好的效果[3,22-23]。萜类物质Austalide N最初是从土曲霉发酵液中分离得到的，对-葡萄糖苷酶有抑制作用[24]。酮类化合物cycloartobilxanthone不仅对P-388细胞具有细胞毒性，还通过抑制迁移FAK和CDC42信号，减少迁移细胞的丝状伪足，降低整联蛋白5、v和3以及通过抑制EMT等方式抑制肺癌细胞迁移和侵袭，具有一定的抗癌作用[25-26]。酸酐化合物ceramidastin是神经酰胺酶抑制剂，对一些可以产生神经酰胺酶而导致的细菌性皮炎具有一定的治疗效果[27]。孢梗束中这些生物活性代谢物的存在充分说明了孢梗束可能具有较大的药用潜力。目前在虫草菌的实际应用中，并不将孢梗束或子实体与其它部分分开应用，从本研究结果来看，孢梗束与菌丝体的代谢成分具有较大差别，而化学成分是一切药材的药效基础，因此孢梗束与菌丝体可能具有较大药效差别，值得对这两部分的药效考察和应用研究做进一步的研究。