微创和开放肺癌切除术对肺腺癌患者围术期循环肿瘤细胞的影响

郭建宇，齐宝林，齐晓轩

(1.牡丹江医学院；2.牡丹江医学院附属红旗医院，黑龙江 牡丹江 157011)

肺癌是迄今为止全球癌症死亡的主要原因。腺癌是肺癌的重要病理类型，其发病年龄普遍低于鳞癌和小细胞癌，多为周围型，且发病率逐年上升，已经超越鳞癌成为最常见的肺癌，大约占肺癌的30%～40%。CTC是从原发性肿瘤和或转移性病变中脱落并在血流中循环的肿瘤细胞[1]。有研究表明外周血CTCs细胞数量是恶性肿瘤患者术后复发或肿瘤转移的独立危险因素[2-3]。通过检测外周血中CTC是一种无创且操作简单的方法。目前一些研究已明确表明动态监测循环肿瘤细胞对评估肺腺癌患者的预后及治疗效果有重要意义。本研究采用免疫磁珠法对肺腺癌患者围术期外周血CTCs动态监测，并对比分析微创肺腺癌切除术组和开放肺腺癌切除术组对围术期CTCs动态变化的影响，为临床患者选择微创或开放式手术以及对术后患者的治疗效果的评估提供参考。

1 对象和方法

1.1 一般资料收集我院自2018年7月至2019年11月间来本院行肺癌根治术的肺腺癌患者。纳入标准：(1)手术前影像学检查头部胸部CT腹部彩超等提示有手术指征并且没有出现转移；(2)手术前的一般检查血常规，生化常规，心脏彩超，肺功能，血气分析等对肺腺癌切除术无手术禁忌；(3)根据手术前胸部CT，三维重建等检查，肿瘤最长横径≤7cm且无外侵；(4)无因肺裂发育不全及粘连导致手术时间延长；(5)术前未接受新辅助治疗的患者；(6)术后病理结果由最新肺癌指南分期的TNM分期进行分期；排除标准：(1)不能耐受肺腺癌切除术；(2)出现远处转移或其他器官发现原发肿瘤。(3)手术资料不全。最终共纳入61例，其中31例微创手术患者，30例开放手术患者。本研究经我院伦理委员会批准，并经过患者及家属同意。

1.2 手术方法微创组和开放组均为同一位手术医师。微创肺腺癌切除术：全身麻醉单孔胸腔镜下，先打开肺裂，游离切断肺静脉，游离肺动脉并离断，分离组织后切断支气管，切除游离肺叶的同时清扫肺内及肺门部位的淋巴结，肺叶切除标本取出后系统性清扫纵隔淋巴结。开放肺腺癌切除术：全身麻醉下，先打开肺裂，游离切断肺静脉，游离肺动脉并离断，分离组织后切断支气管，切除游离肺叶的同时清扫肺内及肺门部位的淋巴结，肺叶切除标本取出后系统性清扫纵隔淋巴结。

1.3 检测方法所有患者分别于术前3d，手术中肿瘤切除及淋巴结清扫完毕后，手术后3d，采集外周静脉血7.5mL于枸橼酸抗凝管中，室温保存。12h内室温800r/s离心6min,用巴氏滴管吸取中间层。1mL细胞悬液加入4mL红细胞裂解液(1:4～1:5)，充分混匀置于室温孵育，10min后待样本呈透明红色，室温离心机300r/s离心10min，吸取裂解液并丢弃。加入400μL PBS缓冲液，室温800r/s离心5min，弃去裂解液，加入400μL PBS缓冲液重悬，获得单个核细胞。对样本进行细胞计数，加入CD326(上皮细胞黏附因子)免疫磁珠和Fc受体阻断剂,置于4℃恒温箱中孵育，30min后加入MS柱,收集经吸附的阳性部分细胞。洗涤重悬后再加入细胞角蛋白(cytokeratin,CK-PE)和 CD45-FITC荧光单克隆抗体,混匀后置于4℃恒温箱孵育30min后,进行流式细胞仪检测。同时满足CK-PE标记阳性，CD45-FITC标记为阴性的细胞即为CTCs。CTCs阳性标准为CTCs≥3个。

1.4 统计方法应用SPSS 23.0统计软件进行统计分析，数据以“均数±标准”差表示。正态分布的数据使用t检验和方差分析，非正态分布的数据用非参数秩和检验。卡方检验分析两组一般资料，P<0.05有统计学意义。

2 结果

2.1 两组肺腺癌患者一般资料比较两组分别由31例和30例肺腺癌患者组成，其中微创肺腺癌根治术组男性20例，女性11例，平均年龄(60.61±7.66)岁；开放肺腺癌根治术组男性16例，女性14例，平均年龄(59.13±8.97)岁。微创组和开放组在性别、有无吸烟史、术后TNM分期等方面差异均无统计学意义(P>0.05)。

2.2 两组肺腺癌患者术前CTCs检测比较61例肺腺癌患者中，术前3d CTCs检测阳性率57.4%(35/61)。微创组肺腺癌切除术组阳性率54.8%(17/31),开放组肺腺癌切除术组阳性率60.0%(18/30)。两组比较差异无统计学意义(χ2=0.166,P=0.684),见表1。

表1 两组肺腺癌患者术前CTCs检测比较

2.3 两组肺腺癌患者不同手术阶段CTCs水平的变化61例肺腺癌患者，肺腺癌切除术术中外周血循环肿瘤细胞的水平高于术前(P<0.001),肺腺癌切除术后3日外周血CTCs水平高于术中(P<0.001)，差异均有统计学意义。微创肺腺癌切除术组和开放肺腺癌切除术组在术前3d和术中外周血循环肿瘤细胞水平比较差异无统计学意义(P>0.05)，微创肺腺癌切除组术后3d外周血循环肿瘤细胞水平明显低于开放肺腺癌切除术组(P<0.05)。微创肺腺癌切除术组术前到术后循环肿瘤细胞增幅水平明显低于开放组(P<0.001)，见表2。

表2 两组肺腺癌患者不同手术阶段CTCs水平的变化

3 讨论

目前，随着医学技术的发展肺腺癌患者的治疗已经获得巨大的进展，一方面微创手术已进入传统开放手术领域，并且分子靶向药物和免疫治疗在肺腺癌治疗中的应用也日渐增多，但耐药现象的出现，使治疗难度明显加大，另一方面手术可以将肿瘤完整切除同时清扫淋巴结，故手术仍为治疗本病的重要手段。随着医疗技术的发展，以及胸腔镜技术在胸外科领域的应用，越来越多的研究人员开始探索微创技术对肺腺癌的治疗效果。肺腺癌患者5年生存率仍不高，预后较差的主要原因是转移和复发。通常用来判断肺腺癌患者预后的主要因素是肿瘤病理分期，但肿瘤起病隐匿，即使发现也需手术后才能准确评价其分期。处于辅助治疗阶段的肿瘤患者通常只能通过影像学检查来评估患者治疗情况。这些复杂的因素使得评价患者病情进展具有一定局限性。近年来，循环肿瘤细胞的研究越来越广泛，循环肿瘤细胞(Circulating tumor cell，CTC)，是由原发病灶或转移病灶脱落的恶性肿瘤细胞。当前一些研究显示，在肿瘤转移之前，依靠一部分原发肿瘤细胞经历上皮间质转化(ePithelial mesenchymal transitions，EMT)等过程从而获得高度的侵袭能力，从原发或者转移灶脱落，进入血液系统，大多数CTCs被机体免疫系统消灭，只有极少数侵袭力极高的CTCs存活下来并进入到转移脏器，进而逃脱宿主的非特异免疫杀伤，增殖生长并最终形成转移灶[4]。CTCs的检测具有操作取样简单，可多次重复取样，创伤小，患者易接受等优点。目前已经应用于一些肿瘤相关的疾病，美国已批准将循环肿瘤细胞应用于乳腺癌和前列腺癌的筛查[5-6]。本文关于肺腺癌患者围术期CTCs的研究表明，不论是微创还是开放肺腺癌切除术术中及手术后外周血的循环肿瘤细胞量较术前均有所增加，提示手术过程中挤压肿瘤组织可导致肿瘤细胞机械入血[7-8]。因此胸外科医生手术过程中应该坚持无瘤原则，尽量避免对肿物的挤压和搬动。术后CTCs的数量显著高于术前及术中，提示一方面由于手术创伤及手术应激对患者生理内环境、免疫功能的影响可能会减弱机体免疫系统对CTCs防御。另一方面，不论是微创手术还是开放手术，在操作过程中不可避免的挤压肿瘤组织，导致肿瘤细胞不同程度的入血。外周血中CTCs数量的增多可能导致肿瘤转移和复发的几率相对增加[9]。对于大多数肺腺癌患者而言，他们都死于肿瘤的复发转移，这可能与循环肿瘤细胞有密不可分的关系。CTCs作为新型的液体活检手段，正在被越来越多的癌症中心所接受。

本研究对不同手术方式肺腺癌患者CTCs变化的研究显示，微创肺腺癌切除术组和开放肺腺癌切除术组术中外周血循环肿瘤细胞数量的变化无明显差异。但微创组较开放组术后外周血循环肿瘤细胞数量明显降低，这些提示微创手术能显著减少术后外周血中CTCs的量。且有研究显示微创手术术后患者疼痛轻，皮肤创伤小，恢复时间快，患者机体免疫防御恢复快，有利于机体对CTCs的灭杀。

综上所述，我们比较了微创肺腺癌切除术组和开放肺腺癌切除术组对肺腺癌患者围术期外周血CTCs的影响。结果表明，微创手术有助于降低术后早期外周血中因手术播散的CTCs量，为术后患者的治疗效果的评估以及临床患者手术方式的选择提供参考。然而本研究在样本收集受到限制，因此得出的结论有一定偏差。