苹果ANR基因沉默的原因分析

印迈 吴玉杰 蔡梦

摘要    检测了一个具有紫黑色果肉的苹果的ANR基因，发现了该基因被沉默。为了分析其沉默的原因，通过试验分析了该启动子序列上的顺式作用元件、内含子序列、外显子序列等的变异。结果表明，其ANR基因沉默可能是由內含子产生的变异引起，上述研究结果为今后的进一步研究打下了基础。

关键词    苹果;ANR基因;内含子;基因沉默

中图分类号    S661.1        文献标识码    A

文章编号   1007-5739（2020）15-0057-03                                                                                     开放科学（资源服务）标识码（OSID）

Abstract    The ANR gene of an apple with purple-black pulp was detected， and it was found that the gene was silenced. In order to analyze the causes of ANR gene silencing， the variations of cis-acting elements， intron sequences and exon sequences on the promoter sequence were experimentally studied. The results indicated that the ANR gene silencing may be caused by the variation produced by the intron. The above results laid a foundation for further research in the future.

Key words    Malus domestica; ANR gene; intron; gene silencing

花青素还原酶（简称ANR酶）是花青素代谢途径中的关键酶，随着其在植物不同部位表现出不同的活性，使得果实以及花瓣呈现不同的颜色[1]。在ANR酶催化作用下，花青素会被转化成原花青素（PA），而不会生成花青苷[2]。在拟南芥中过量表达ANR基因，会增加细胞中的原花青素含量、减少花青素含量[3-4]。研究ANR基因的表达调控将为通过基因工程改良植物的花青素合成性状打下基础，目前已经有一些关于ANR基因研究的文献报道[5-7]。前期研究发现，一个苹果（Malus domestica）种质材料的ANR基因不表达，拟通过本试验寻找可能的原因。

1    材料与方法

1.1    试验材料

3种苹果的嫩叶。

1.2    DNA的提取

采用北京艾德莱生物科技有限公司的DN14-植物基因组DNA快速提取试剂盒提取DNA。

1.3    RNA的提取和cDNA的合成

采用北京艾德莱生物科技有限公司的RN53-多糖多酚复杂植物RNA快速提取试剂盒进行总RNA的提取，用同一公司的PC44-第一链60 ℃高温反转录试剂盒合成cDNA第一链。

1.4    引物

用于检测苹果ANR基因mRNA（GenBank中的登录号为XM_029110431.1，基因编号为LOC114827797）表达的上游引物序列为TCAACAAAAGATACCCCCAG，下游引物序列为GATAGCTAGCTCGATACATGC。用于PCR扩增涵盖该ANR基因开放阅读框区域基因组DNA的上游引物序列为TTCCGATTCGATTGGACG，下游引物序列为ACACGCCGCT GTTGCTTT。用于PCR扩增该ANR基因启动子序列的上游引物序列为ATCTGTGCTGGGTTCTTCTT，下游引物序列为CTGACGGTGGTTCTGACG。引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.5    测序

将PCR扩增得到的DNA产物进行琼脂糖凝胶电泳，切取含目的条带的凝胶，采用北京艾德莱生物科技有限公司的DR01-琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒回收DNA片段，送南京擎科生物科技有限公司测序。

1.6    序列分析

采用DNAStar软件进行DNA和mRNA序列的拼接和比对，在PLACE网站进行顺式作用元件在线分析，网址为https：//www.dna.affrc.go.jp/PLACE/？action=newplace。

2    结果与分析

2.1    cDNA的PCR扩增

对来源于3种不同苹果的嫩叶cDNA样品进行PCR扩增，然后将获得的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结果如图1所示。可见看出，1号和2号苹果嫩叶cDNA可以有效地扩增出DNA目的条带，而3号苹果嫩叶cDNA却没有扩增出相应的DNA条带，表明该基因的mRNA在3号苹果叶片中没有成功转录。由于3号苹果嫩叶cDNA样品用其他引物能够扩增出条带，显然cDNA样品质量没有问题，剩下的可能原因就是此种苹果材料的ANR基因发生了变异或其他原因。

2.2    3号苹果ANR基因的基因组序列和启动子序列的获得

为了回答上述问题，提取了3号苹果的基因组DNA，用一对引物PCR扩增ANR基因上游的启动子序列和部分对应于mRNA的DNA序列，用另一对引物PCR扩增对应于ANR基因mRNA的DNA序列。引物设计时已经考虑到2对引物PCR扩增获得的2段序列要有1段重叠序列，因而在测序后将2段序列进行拼接，获得了5 315 bp长度的DNA序列（图2）。

2.3    mRNA检测引物序列的比对分析

将mRNA检测引物序列与上述获得的DNA序列进行比对，结果表明，两者100%同源。说明未从3号苹果cDNA样品PCR扩增到DNA条带，不是由于对应的基因序列发生变异所引起。

2.4    启动子序列和顺式作用元件比较分析

取上述获得的序列转录起始点A上游1 kb的DNA序列进行启动子序列和顺式作用元件比较分析。与NCBI数据库中ANR基因（编号LOC114827797）启动子相比，有23处发生了碱基替换，分别为836T/C、841C/A、973C/T、983C/T、1 015T/C、1 018T/C、1 047A/G、1 057C/T、1 070A/G、1 074C/T、1 106C/T、1 143A/G、1 164T/A、1 298G/A、1 331G/A、1 343A/T、1 462A/T、1 472G/A、1 554G/T、1 621A/T、1 680A/G、1 748T/A、1 801T/G;2处发生了缺失，分别为1 164～1 165缺失AA、1 766～1 767缺失T。

与NCBI数据库中ANR基因（编号LOC114827797）启动子相比，绝大多数的顺式作用元件一致，缺少了5种顺式作用元件和增加了1种顺式作用元件（表1）。从这些增加和减少的顺式作用元件的功能看，3号苹果材料中相应的ANR基因不表达不太可能与启动子的变异有关。

2.5    外显子和内含子序列变异分析

从外显子和内含子序列变异分析可见，第1外显子有3处碱基发生了替换，第5外显子有1处变异，其他外显子没有变异;第1内含子有39处发生变异，第2～5内含子都有不同数目的碱基变异（表2）。

外显子的变异很少，内含子的变异较多。mRNA序列上起始密码子到终止密码子长度为1 020 bp，对应的DNA区域的序列共有3处变异，翻译成蛋白质序列共有339个氨基酸残基长度，其中仅有1个氨基酸由甲硫氨酸变异为缬氨酸，位于第21个氨基酸的位置。因此，内含子的变异可能阻碍了相应ANR基因的转录。

3    结论与讨论

外源DNA片段随机插入基因的内含子有时会影响mRNA的转录，内含子自身产生变异也有可能影响mRNA的转录。在本研究中观察到3号苹果材料ANR基因的5个内含子均有不同程度的变异，ANR基因的沉默可能是由此引起。特别是第1内含子变异最多，变异类型包括碱基替换、缺失和插入，但是由哪一个内含子的变异引起了基因的沉默仍然需要进一步研究。突变的内含子DNA片段是否能引起其他基因的沉默、如何引起沉默等，都值得进一步试验研究。

Xie等[4]增强ANR基因在拟南芥中的表达，导致了细胞中花青素含量的下降，而原花青素的含量则上升[4]。李先良等[6]研究结果表明，具有红色果实的芒果，其ANR基因表达量较低。严  娟等[7]研究认为，桃子果肉原花青素含量与ANR酶活性密切相关。这些研究都表明，较低的ANR基因表达量，致使花青素的含量上升，意味着果肉的颜色变深。3号苹果的果肉呈紫黑色，與白色和浅红色的1号、2号苹果相比，相应的ANR基因表达水平应该最低，试验已经表明无法检测到该基因的mRNA，确实与前述符合。目前，通过自然变异导致ANR基因沉默的研究，还没有见到同类文献报道。如果希望其他苹果果肉由浅色变为紫黑色，除了使用本试验材料杂交育种外，也可以利用基因工程手段敲除ANR基因。

4    参考文献

[1] 宋冰雪，曲盈媛，苏强，等.笃斯越橘花青苷合成酶基因（ANR）的克隆与序列分析[J].延边大学农学学报，2017，39（4）：1-6.

[2] 黄艺宁.葡萄原花青素研究及其ANR基因的克隆[D].福州：福建农林大学，2008.

[3] 王晨，房经贵，曹雪，等.葡萄中原花青素的代谢[J].中国农学通报，2009，25（9）：169-173.

[4] XIE D Y，SHARMA S R，PAIVA N L，et al.Role of anthocanidin reductase，encoded by BANYULS in plant flavomoid biosynthesis[J].Science，2003， 299：396-399.

[5] 马敬，苏磊，袁美，等.花生C4H和ANR基因的克隆与表达研究[J].核农学报，2012，26（1）：43-48.

[6] 李先良，赵志常，高爱平，等.芒果ANR基因的克隆及其表达分析[J].江苏农业科学，2017，45（4）：22-25.

[7] 严娟，宋志忠，蔡志翔，等.3种果肉颜色桃原花青素积累[J].江苏农业学报，2018，34（3）：651-656.