胶原蛋白肽对凝固型酸奶品质的影响

董世荣,徐 微,李 欣,孙 宇

(1.哈尔滨学院食品工程学院,黑龙江哈尔滨 150086;2.哈尔滨学院食品生物技术重点实验室,黑龙江哈尔滨 150086)

胶原蛋白是动物体内的主要结构蛋白,在形成器官和维持细胞完整性等方面起到至关重要的作用[1]。基于胶原蛋白具有促进钙吸收、保护极性酒精性胃黏膜、修复化学肝损伤等方面的功效,其在食品、医药、生物材料等领域得到广泛关注[2-5]。由于胶原蛋白独特三股螺旋结构消化吸收困难[2],经酶修饰后得到的胶原蛋白肽吸收利用程度高、乳化性强[6],可被应用于酸奶等乳制品中。酸奶是一种以牛乳为原料经过乳酸菌(嗜热链球菌和保加利亚杆菌)发酵而成的乳制品[7],因其具有很高的营养价值、独特的风味和保健功能而受到广大消费者喜爱。目前酸奶市场前景广阔、竞争激烈,如何提高产品的品质成为占据市场竞争优势的关键[8]。

评价酸奶品质的指标主要有质构特征、乳清析出率、流变学特性、感官评价等。通过控制酸奶中蛋白质(肽)的添加、发酵菌种、加糖量、温度等可以有效地改善酸奶质量。例如,赵强忠等[9]研究发现适度酶解的大豆蛋白可以促进酸奶发酵,改善酸奶储藏品质,而且具有更多的疏水氨基酸和不带电亲水氨基酸的小分子组分作用更显著。大豆分离蛋白质经过胰蛋白酶水解后可提高酸乳在储藏期间的粘度[10]。乳清浓缩蛋白粉的添加可以改善凝固型酸的持水能力、粘弹性等指标[11]。不同温度发酵的酸奶之间品质存在显著差异,而且在相同温度下发酵的无乳糖酸奶和普通酸奶之间的品质也存在不同[12]。将胶原蛋白添加至酸奶中可以得出一款品质佳、营养价值高的胶原蛋白酸奶[13-14]。但是目前针对胶原蛋白肽对酸奶品质的影响以及如何定量评估其对酸奶品质的影响程度并没有明确。

因此,本研究系统地研究了胶原蛋白肽的添加量对酸奶的持水能力、酸度、pH、质构特性、发酵以及微观结构的影响,并且对胶原蛋白肽添加量对这些指标的影响进行了归一化,旨在定量反映胶原蛋白肽对酸奶品质影响规律，为开发胶原蛋白肽酸奶奠定一定的理论基础和指导实践生产。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

深海鳕鱼胶原蛋白肽(蛋白质含量≥99%,分子肽量1000～3000 Da,分子呈棒状,由2条α1链,1条α2链组成,属于三聚体) 主要为Ⅰ型胶原蛋白肽,河南兴源化工产品有限公司;鲜牛奶 符合GB 19301-2010规定[15],双城雀巢有限公司;脱脂奶粉 符合GB 19644-2010规定[16],双城雀巢有限公司;混合乳酸菌种(保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌) 安琪酵母股份有限公司。

CT3食品物性测定仪 美国Brookfield公司;S-3400N扫描电子显微镜 日本日立公司;Allegra64R centrifuge型离心机 德国Beckman公司;LRH-150生化培养箱 上海一恒科技有限公司;DK-98上海数显恒温水浴锅 天津泰斯特有限公司;GJB30-40实验室高压均质机 惠合机械设备有限公司;YP202N电子天平 上海精密仪器科学有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 酸奶制备流程 利用鲜牛奶溶解脱脂奶粉,配制蛋白质浓度3.5%的原料乳,将原料乳均匀分为10等份,将0.0(即无添加)、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%(相对原料乳中蛋白质含量的百分比)胶原蛋白肽(Cpa)和50 g/kg(蔗糖质量/乳质量)的蔗糖分别添加至10份原料乳中。90 ℃杀菌10 min,然后冷却至发酵温度42 ℃,接种0.08 g/kg发酵菌种,将每份制备样品平均分装至3个50 mL灭菌瓶中,42 ℃发酵8 h后置于4 ℃冰箱24 h,完成酸奶样品制备[11]。本研究制备的胶原蛋白肽酸奶的感官指标、理化指标和微生物指标均符合GB 10302-2010。

1.2.2 持水能力测定 取一定量的酸奶样品放置已知重量的离心管中,离心管的质量记为W,称取其质量W1,然后在4 ℃、1000×g离心力下离心10 min,将上清液去掉,称去沉淀和离心管的质量W2,按照下式计算酸奶样品的保水性(WHC)[7]。WHC可表示为:

式(1)

1.2.3 质构特性测定 基于质地多面分析法(TPA)模式[7],在室温下利用质构仪测定酸奶样品的质构特性,包括硬度(Ha)、粘性(Ad)、弹性(Sp)、胶着性(Gu)、咀嚼性(Ch)和内聚性(Co)。测定参数设置为:TA4/1000探头、预测速度1.0 mm/s、测试前速度2.0 mm/s、测试后速度2.0 mm/s、穿透测试深度30.0 mm、感应力大小10.0 g。

1.2.4 pH和滴定酸度(TA)的测定 利用去离子水按照1∶1的比例稀释酸奶样品,利用PE28型梅特勒pH计测定酸奶样品的pH。基于乳酸的百分比利用滴定法测定酸奶样品的滴定酸度[10,17]。利用酚酞作为指示剂,用0.1 mol/L的NaOH进行滴定,测定消耗的NaOH体积(V)。

1.2.5 酸奶发酵凝固时间的测定 将酸奶样品瓶倾斜30 °,在开始发酵后的6、8、10 h,观察酸奶的凝固状态。观察的状态分为未凝固、表面凝固和完全凝固。表面凝固指在发酵相应时间为凝固,但是在倾斜30 °时有液体流动,完全凝固时静止或者倾斜30 °时均为凝固状态。

1.2.6 微观结构的测定 利用扫描电镜酸奶样品的微观结构[18],具体步骤如下:从表面>10 mm处取4 mm×4 mm×3 mm(长×宽×高)酸奶样品;将其固定在含有25 g/kg戊二醛的0.1 mol/L磷酸缓冲溶液(pH6.8)中24 h(环境温度4 ℃);利用0.1 mol/L磷酸缓冲溶液(pH6.8)冲洗3次,每次10 min;先后利用体积分数为50%、70%、90%的乙醇各脱水一次,每次15 min;利用体积分数100%的乙醇脱水3次,脱水10 min;等体积的100%乙醇和叔丁醇混合溶液脱水1次,脱水10 min,纯叔丁醇脱水1次,脱水10 min;冷冻干燥;固定、镀金;上镜观察微观结构(25 kV)。

1.3 数据分析

数据均以平均值±标准差表示(n=3)。试验数据采用Origin 8.0和Statisix 8.1软件对试验数据进行统计分析(P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 不同添加量的胶原蛋白肽对酸奶持水能力的影响

如图1a所示,胶原蛋白肽的添加显著(P<0.05)影响酸奶的持水能力,酸奶的持水能力随胶原蛋白肽添加量的增加整体呈上升趋势,当胶原蛋白肽添加量低于0.6%时,持水能力增长快速(76%增长至86%);当胶原蛋白肽添加量在0.6%～1.0%时,持水能力变化不明显(86%～89%),当胶原蛋白肽添加量在1.0%～5.0%时,持水能力增长缓慢并逐渐收敛于稳定值(92.66%)。蛋白质与水相互作用的能力取决于蛋白质表面氨基酸残基的组成,带电荷/极性氨基酸与水分子结合能力较强[19],胶原蛋白肽增强了酸奶中极性或带电基团,通过静电作用提高了酸奶的持水能力[20]。

图1 胶原蛋白肽添加量对酸奶样品持水能力(a)的影响和归一化(b)结果Fig.1 Effect of the different addition amount of collagen peptide(Cpa)on water holding capacity(WHC,a) and regressed result(b)of generalized WHC(WHCg)of set-style yoghurt

为定量反映胶原蛋白肽添加量对酸奶持水能力的影响规律,本研究采用ExpDec单指数函数拟合归一化的持水能力(WHCg:添加不同量胶原蛋白肽酸奶样品持水能力与未添加胶原蛋白肽酸奶样品平均持水能力的比值,见图1b),WHCg最小二乘法回归分析可表示为:

式(2)

本回归方程反映出胶原蛋白肽添加量与酸奶持水能力呈现单指数函数的关系,可以定量确定在酸奶持水能力达到目标值时胶原蛋白肽的添加量。

2.2 不同添加量的胶原蛋白肽对酸奶酸度和pH的影响

如图2所示,胶原蛋白肽的添加提高了酸奶的pH,但降低了酸奶的滴定酸度。当胶原蛋白肽添加量从0增加至2.0%时,酸奶的pH由4.20快速地线性增长至4.47,而滴定酸度则由131.00 °T迅速地下降至113.67 °T;当胶原蛋白肽添加量继续从2.0%增加至5.0%时,酸奶的pH略有上升,滴定酸度保持缓慢下降趋势,最终下降至108.67 °T。pH的上升或滴定酸度的降低说明添加胶原蛋白肽对酸奶中有机酸的产生具有抑制作用[17]。

图2 不同添加量胶原蛋白肽酸奶样品pH和滴定酸度(TA)随Cpa的变化和归一化回归分析Fig.2 Changes of pH value and titratabe acidity(TA)of yoghourt samples and regressed results of generalized pH(pHg),titratabe acidity(TAg)varied with Cpa

为定量地反映胶原蛋白肽的添加对酸奶pH和滴定酸度的影响,本研究分别建立了归一化pH(pHg)和归一化滴定酸度(TAg)的经验模型,pHg和TAg最小二乘法回归结果可表示为:

pHg=1.15-1.13×0.18Cpa

式(3)

式(4)

pH、滴定酸度与胶原蛋白肽添加量的归一化公式得出胶原蛋白肽添加量与酸奶pH、持水能力均呈现单指数函数的关系,通过归一化的公式可以通过调控胶原蛋白肽的添加量确定酸奶的发酵程度。

2.3 不同添加量的胶原蛋白肽对酸奶发酵的影响

如表1所示,胶原蛋白肽的添加延长了酸奶的发酵时间,添加量越大延时越明显。酸奶样品发酵6 h后,胶原蛋白肽添加量低于0.6%的酸奶样品表面凝固,胶原蛋白肽添加量高于0.6%的酸奶样品表面均未凝固;发酵8 h后,胶原蛋白肽添加量低于0.6%的酸奶样品完全凝固,胶原蛋白肽添加量在0.8%～2.0%的酸奶样品表面凝固,胶原蛋白肽添加量大于2.0%的酸奶样品未凝固;发酵10 h后,胶原蛋白肽添加量在0.8%～1.0%的酸奶样品完全凝固,胶原蛋白肽添加量大于2.0%的酸奶样品未凝固。但是所有的样品在后熟24 h后均凝固。胶原蛋白肽的添加对酸奶发酵的影响可能是由于其打破了发酵菌种联合发酵的平衡[21],也可能是由于其降低了乳中蛋白质碰撞交联的几率而延缓酸奶凝胶结构的形成[22]。

表1 酸奶发酵状态随胶原蛋白肽添加量的变化Table 1 Changes of yoghurt concretionary state as the addition of Cpa

2.4 不同添加量的胶原蛋白肽对酸奶质构特性的影响

本研究测定的不同添加量胶原蛋白肽的酸奶样品的硬度(Ha)、粘性(Ad)、弹性(Sp)、胶着性(Gu)、咀嚼性(Ch)和内聚性(Co)如图3所示。胶原蛋白肽的添加明显改变酸奶的硬度、粘性、胶着性和咀嚼性,随着胶原蛋白肽添加量增加这4个指标整体均呈现衰减趋势,但胶原蛋白肽的添加对酸奶的弹性和内聚性几无影响。当胶原蛋白肽添加量低于2.0%时,硬度、粘性、胶着性、咀嚼性衰减十分迅速,分别由未添加时的236 g、5.27 mJ、105.00 g和8.30 mJ快速下降至1.0%添加量时的153.33 g、2.93 mJ、58.67 g和5.30 mJ,分别降低了35.0%、44.4%、44.1%和36.1%,4个指标的衰减速度较为一致。当胶原蛋白肽添加量在2.0%～5.0%时,由胶原蛋白肽添加量增加引起的这4个指标的下降趋势略有差异。随着胶原蛋白肽添加量的增加粘性以跃阶形式快速衰减,由2.0%～3.0%添加量时的稳定值跳跃降低至4.0%～5.0%添加量时的稳定值,在5.0%添加量时衰减至1.57 mJ(降低了70.2%);随着胶原蛋白肽添加量的增加其它3个指标的衰减趋势逐渐减弱,在5.0%添加量时分别衰减至127.33 g、48.00 g和4.30 mJ(降低了46.0%、54.3%、48.2%)。酸奶粘性与乳中酪蛋白尺寸密切相关,尺寸越小粘性越低[23],胶原蛋白肽可能影响酸奶中酪蛋白胶束的形成,进而降低了酸奶的粘性。

图3 不同酸奶样品的质构特性随胶原蛋白肽添加量的变化Fig.3 Textural characteristic of yogurt sample varied with Cpa注:Ha:硬度;Ad:粘性;Sp:弹性;Gu:胶着性;Ch:咀嚼性;Co:内聚性。

为定量表示胶原蛋白质太添加量对酸奶硬度、粘性、胶着性、咀嚼性的影响规律,从而有效调控胶原蛋白肽添加量对酸奶质构特性的定量影响。本研究采用Log3p1模型拟合归一化的硬度(Hag)、胶着性(Gug)和咀嚼性(Chg),采用BiDoseResp模型拟合归一化的粘性(Adg)(图4),指标归一化值表示添加不同量胶原蛋白肽酸奶样品的指标测量值与未添加胶原蛋白肽酸奶样品指标测量均值的比值,利用最小二乘法回归分析得到的Hag、Adg、Gug和Chg经验模型分别表示为:

图4 归一化的胶原蛋白肽酸奶硬度(Hag)、粘性(Adg)、胶着性(Gug)和咀嚼性(Chg)的回归分析结果Fig.4 Regressed results of generalized hardness(Hag),adhesiveness(Adg), gumminess(Gug),chewiness(Chg)of Cpa yoghurt by least-square fitting

Hag=0.77-0.14×ln(Cpa-0.01)

式(5)

式(6)

Gug=0.65-0.11×ln(Cpa-0.01)

式(7)

Chg=0.72-0.07×ln(Cpa)

式(8)

2.5 不同添加量的胶原蛋白肽对酸奶微观结构的影响

胶原蛋白肽明显改变了酸奶的微观结构,且添加量越高对酸奶微观结构影响越大(图5)。未添加胶原蛋白肽酸奶样品的凝胶网络结构均匀、细致、有规则、蛋白质分布更平滑和具有系统性,蛋白质之间交联程度高,孔隙度均匀,蛋白质高交联度降低了凝胶的渗透性[24],表现出较高的硬度(图3)。与未添加胶原蛋白肽酸奶样品微观结构相比,添加0.6%的胶原蛋白肽酸奶样品的微观结构变化很小,形成的网络结构仍紧密、细致,蛋白质之间交联度高;添加1.0%胶原蛋白肽改变了酸奶凝胶的网络结构,孔隙度均匀性降低且空隙变大,蛋白质之间的交联程度降低,凝胶结构变粗糙;添加2.0%或5.0%胶原蛋白肽时,酸奶凝胶网络结构更粗糙、疏松、不均匀、孔隙度更大、蛋白质之间的交联效果变差。酸奶的微观结构与质构特性密切相关[25],胶原蛋白肽的加入破坏了酸奶蛋白质之间的交联,而蛋白质交联程度与酸奶凝胶硬度呈正相关[24],即随着胶原蛋白质肽添加量增加酸奶凝胶硬度呈现降低趋势(图2)。静电、极性、疏水作用是形成凝胶的主要作用力,静电相互作用/极性相互作用的平衡促进凝胶的形成[23],胶原蛋白肽的加入打破了原料乳中这种平衡,进而改变了酸奶凝胶结构。结合酸度变化和发酵的结果发现,添加胶原蛋白肽抑制了乳酸菌的发酵,进而影响了酸奶凝胶的形成,从而使质构和微观结构变差。

图5 添加不同量胶原蛋白肽酸奶样品的微观结构(1000×)Fig.5 Effect of Cpa on yogurt micromorphology(1000×)注:a:Cpa=0;b:Cpa=0.6%;c:Cpa=1.0%;d:Cpa=2.0%;e:Cpa=5.0%。

3 讨论与结论

胶原蛋白肽的添加改变了酸奶的多孔网状结构进而改变了持水能力,多孔网状结构改变源于胶原蛋白肽影响着酸奶的发酵。因为多肽的疏水性和电荷性影响着生物的利用度,当多肽中含有较高的组氨酸、赖氨酸、谷氨酸和丝氨酸等亲水氨基酸时可以提高乳酸菌的生长活性[9]。适量的添加胶原蛋白肽可以改变酸奶中氨基酸的组成,从而改善酸奶的发酵过程,但是当大量的胶原蛋白肽添加至酸奶时,不利于酸奶的发酵。Shori等[17]试验研究也发现胶原蛋白添加至酸奶中改变了酸奶发酵。这种发酵的影响一定程度上改变了酸奶的质构特性。

添加胶原蛋白肽影响酸奶的品质,酸奶品质的变化可能归因于胶原蛋白肽影响了酸奶的发酵,而发酵影响了酸奶网络结构的形成。而且胶原蛋白肽对酸奶品质的影响程度与其添加量有关。添加量≤0.6%时,随添加量的改变酸奶品质变化明显;添加量>0.6%时,随添加量的改变酸奶品质变化不明显。本研究提出了定量评估胶原蛋白添加量对各类指标归一化结果影响程度的经验模型。