不同绵羊品种FSHR基因多态性及其与产羔数的关联分析

刘玲玲，马海玉，刘武军

(新疆农业大学 动物科学学院，乌鲁木齐 830052)

中国绵羊资源丰富，大多数地方绵羊品种为单羔品种，只有少数绵羊为多羔品种[1]。产羔数是家畜关键和复杂的经济性状，也是畜牧业可持续发展的重要因素[2]。产羔数为数量性状，受多基因的控制，但产羔性状的遗传力较低，利用传统选育方法获得的遗传进展较慢，标记辅助选择能够解决效率低下等问题，而寻找可靠的遗传标记则成为关键。

目前已经确定能够影响绵山羊产羔数的基因为BMPR1B(Bone morphogenetic protein receptor1B)基因[3-4]，GDF9(Growth differentiation factor9)基因[5]，SLC5A1(Solute carrier family5member1)基因[6]，MTNR1A(Melatonin receptor1A)基因[7]。而排卵率和胚胎存活率也直接影响羊的产羔数[8]，研究报道，KIT(Tyrosine-protein kinase kit)和NGF(Nerve growth factor)基因能够影响卵泡的生长[9-10]。NCOA1(Nuclear receptor coactivator1)基因对胚胎的存活至关重要[11]，Xu等[12]利用全基因组关联分析研究高产绵羊与低产绵羊之间的差异，筛选出NCOA3(Nuclear receptor coactivator3)基因与Lcelandic绵羊产羔数有关。

KASP(Kompetitive allele specific polymerase chain reaction)技术是目前基因分型的一种重要手段。KASP主要是在广泛的基因组DNA样品中，对SNPs 和特定位点的InDels进行精准的双等位基因判断，从而进行基因分型。主要核心是利用2个通用荧光探针、2个通用淬灭探针，以及多个位点特异引物对SNP位点进行检测。相比于其他的检测SNP方法，KASP技术拥有更高的通量、更快的速度、更低的成本及更准确的结果[13-14]。Zhang等[15]利用KASP技术对造成荷斯坦牛遗传缺陷的5个SNP及3个插入和缺失进行分析。Kusza等[16]利用KASP技术对影响山羊产奶性状的48个SNP进行分析。

笔者前期对新疆不同产羔数绵羊的LAF-Seq测序数据进行GWAS分析，筛选获得可能与绵羊产羔数有关的关键基因之一FSHR[17]。促卵泡激素受体(Follicle-stimulating hormone receptor,FSHR)是GPCR(G protein-coupled receptors)家族的成员，这类受体具有3个受体蛋白链：胞外域、胞内域和跨膜域[18-19]。FSHR转导FSH信号的机制是：FSHR的胞外α-螺旋环和胞外域在细胞膜的表面偶联FSH，FSHR被激活后通过胞内域和跨膜域与G蛋白偶联，最后完成信号转导[20]。研究发现在猪FSHR基因的第10外显子上，rs322800083和rs332115220构成的单倍型C-T可以作为香猪产仔数性状辅助选育的分子标记[21]；黔北麻羊FSHR基因的第1和第10外显子突变对多羔性状具有重要作用[22]。目前未见FSHR基因与阿勒泰羊、吐鲁番黑羊、和田红羊产羔数之间关系的报道。

本试验以阿勒泰羊、吐鲁番黑羊、和田红羊为研究对象，基于NCBI中已有的FSHR基因的错义突变位点(g.75132817C>T，g.75320579G>A，g.75320741G>A)，利用KASP技术对突变位点进行分型，探究不同品种绵羊FSHR基因SNP位点的多态性，并与产羔数进行关联分析，筛选影响不同品种高繁殖力的关键位点，为不同绵羊品种产羔数的选育提供分子标记。

1 材料与方法

1.1 试验动物

65只阿勒泰羊来自福海种羊场，240 只吐鲁番黑羊来自新疆吐鲁番市托克逊县，111 只和田红羊来自新疆和田地区皮山县，均为经产母羊 (2～3胎次)。

1.2 基因组DNA提取

绵羊血液样本使用血液/组织DNA磁珠法提取试剂盒(志昂生物科技有限公司)对DNA进行提取，DNA质量利用 15 g/L琼脂糖凝胶电泳检测。

1.3 主要仪器设备

磁力架(Life Technologies DynaMagTM-2)，离心机(Eppendorf Centrifuge 5424)，Douglas Scientific NEXAR，Douglas Scientific Soellex，Douglas Scientific ARRAY，试剂盒(志昂生物科技有限公司)。

1.4 引物设计与合成

利用Prime 3软件设计引物，由百迈客生物科技有限公司负责完成引物设计及合成。引物具体信息见表1。

表1 引物信息Table 1 Primer information of genes

1.5 PCR反应程序

PCR反应体系：2.5 μL的2×KASP Master Mix，0.07 μL引物，30～50 μg的DNA，总反应体积为5 μL(ddH2O补足)。为避免对试验结果的错误判断，因此设置空白对照(NTC)，其DNA模板用ddH2O代替。PCR反应程序：95 ℃预变性10 min； 95 ℃变性20 s，10个循环，61～55 ℃复性及延伸60 s(-0.6 ℃/循环)，10个循环；95 ℃变性20 s，26个循环；最后55 ℃复性及延伸 60 s，26个循环。反应结束后利用带FRET功能的酶标仪进行荧光数据读取(数据读取在40 ℃以下)。利用LGC_OMEGA软件生成基因的分 型图。

1.6 数据统计方法

利用KASP分型技术对位点分型成功后，计算每个位点的等位基因频率和基因型频率，并进行哈代-温伯格平衡检验。利用SPSS 19.0中单因素方差分析和t检验对平均产羔数和突变位点基因型进行关联分析，产羔数以“平均数±标准差”表示。

2 结果与分析

2.1 3个位点在3 个群体中的KASP分型结果

KASP分型技术是一种灵活的方法，其基因分型错误率为0.7%～1.6%[13]，利用此方法进行FSHR基因的3个位点在阿勒泰羊、吐鲁番黑羊、和田红羊群体中的分型结果可靠。阿勒泰羊群体中，g.75132817C>T位点存在3种基因型：CC、CT、TT；g.75320579G>A位点存在2 种基因型：GG、GA、g.75320741G>A位点存在3种基因型：GG、GA、AA(图1)。吐鲁番黑羊群体中，g.75132817C>T位点存在3种基因型：CC、CT、TT；g.75320579G>A位点存在3种基因型：GG、GA、AA；g.75320741G>A位点存在3种基因型：GG、GA、AA(图2)。和田红羊群体中，g.75132817C>T位点存在3种基因型：CC、CT、TT；g.75320579G>A位点存在2种基因型：GG、GA；g.75320741G>A位点存在3种基因型：GG、GA、AA(图3)。

2.2 3个群体FSHR基因不同位点的基因多态性分析

吐鲁番黑羊群体中，3个位点均为野生型基因型频率高于杂合型和突变型的基因型频率，说明突变的个体数较少，突变频率比较低；阿勒泰羊与和田红羊群体中，g.75132817C>T、g.75320741G>A 2个位点的野生型的基因型频率高于杂合型和突变型的基因型频率，而g.75320579G>A位点的野生型基因型频率低于杂合型的基因型频率，说明g.75320579G>A位点在这2个群体中的突变发生率较高。3个位点在3个群体中均处于哈代-温伯格平衡状态(P>0.05)。在3个绵羊群体中，FSHR基因g.75132817位点的C为优势等位基因；g.75320579位点的G为优势等位基因；g.75320741位点的G为优势等位基因(表2)。FSHR基因g.75132817C>T位点在3个群体中均表现为中度多态(0.25A和g.75320741G>A 2个位点在3个绵羊群体中均表现为低度多态(PIC<0.25)；g.75320579G>A位点在阿勒泰羊群体中的杂合度最低(表3)。对3个位点的连锁情况进行分析，发现3个位点在3个绵羊群体中均不存在强连锁不平衡效应(表4)。

2.3 FSHR基因的3个位点与不同品种羊产羔数的关系

g.75132817C>T位点多态性与和田红羊产羔数有显著关联性(P<0.05)，突变型TT个体产羔数显著高于野生型CC个体。此位点的突变降低阿勒泰羊的产羔数，增加吐鲁番黑羊与和田红羊的产羔数；g.75320579G>A位点多态性与阿勒泰羊产羔数有显著关联性(P<0.05)，野生型GG个体产羔数显著高于杂合型GA个体。此位点的突变降低阿勒泰羊的产羔数，增加和田红羊的产羔数；g.75320741G>A位点多态性与阿勒泰羊和吐鲁番黑羊的产羔数均有关联性，在阿勒泰羊群体中，野生型GG个体产羔数极显著高于杂合型GA个体和突变型AA个体(P< 0.01)，突变导致阿勒泰羊产羔数降低；吐鲁番黑羊群体中，突变型AA个体产羔数显著高于野生型GG个体(P<0.05)，突变导致吐鲁番黑羊产羔数增加；和田红羊群体中，不同基因型产羔数的差异不显著(表5)。

A:g.75132817C>T;B:g.75320579G>A;C:g.75320741G>A；下同 The same below

图2 吐鲁番黑羊FSHR基因3个位点的分型图Fig.2 KASP results of three loci of FSHR gene in Turpan black sheep

图3 和田红羊FSHR基因3个位点的分型图Fig.3 KASP results of three loci of FSHR gene in Hetian sheep

表2 绵羊FSHR基因不同位点的基因型频率和基因频率Table 2 Frequencies of genotype and gene in different loci of FSHR genes in sheep

表3 FSHR基因3个位点在不同绵羊群体中的群体遗传学分析Table 3 Population genetics analysis of three loci of FSHR genes in different sheep populations

表4 不同绵羊群体FSHR基因SNPs 位点连锁不平衡分析Table 4 Analysis of linkage disequilibrium of SNPs of FSHR gene in different sheep populations

表5 FSHR基因SNPs位点各基因型与绵羊产羔数关联分析Table 5 Association analysis of each genotype of FSHR gene SNPs locus with litter size

3 讨 论

3.1 FSHR基因多态性与繁殖性能的关系

对哺乳动物FSHR基因多态性与繁殖性状之间的关系研究较多。研究表明，FSHR基因在动物的繁殖中起关键作用[23-24]。吴井生等[25]对梅山猪的产羔数研究发现，FSHR基因第10外显子存在 2 个多态位点，这 2 个位点对小梅山猪产仔数有显著影响。Zhang等[26]发现FSHR基因第10外显子有3个SNP位点(C1 491T、G1 885A、C1 977T)，结果表明这些SNP可作为猪品种选育的分子标记。Chu等[27]在湖羊FSHR基因的5′侧翼区域发现 2 个突变(g.681T> C和g.629C> T)和小尾寒羊中3个新突变(g.200G> A，g.197G> A和g.98T> C)这5个突变位点均与产羔数有关。Pan等[28]在小尾寒羊和湖羊中发现FSHR基因的5′侧翼区 1 个新的突变位点(g.47C> T)，此位点与产羔数相关。Wang等[29]同样发现FSHR基因的位点(g.47C>T)与小尾寒羊和湖羊的产羔数有关。FSHR基因在山羊中也有研究，潭广梅等[30]对海门山羊FSHR基因进行分析，发现野生型比突变纯合型基因型多0.34只，等位基因与海门山羊产羔数呈显著正相关。马向明等[31]研究发现，在波尔山羊FSHR基因5′上游处检测1个SNP(G-739A)，该突变与平均排卵数(P<0.01)及平均胚胎可利用率显著相关。FSHR基因在猪、羊中均有研究，研究最多的为FSHR基因的第10外显子。在陈祥等[22]的研究中，FSHR基因第1外显子的突变在黔北麻羊和贵州黑山羊群体中存在3种基因型，与本研究中FSHR基因第1外显子 (g.75132817)的结果一致。

3.2 FSHR基因与阿勒泰羊、吐鲁番黑羊、和田红羊产羔数的关系

本研究中，g.75132817位点G突变为A，导致丙氨酸(Ala)变为苏氨酸(Thr)；g.75320579位点G突变为A，导致精氨酸(Arg)变为组氨酸(His)；g.75320741位点C突变为T，导致苏氨酸(Thr)变为异亮氨酸(Ile)。群体遗传学分析结果表明，FSHR基因g.75132817C>T位点在阿勒泰羊、吐鲁番黑羊、和田红羊群体中为中度多态，说明这个位点的选择潜力比较大，而g.75320579G>A和g.75320741G>A 2 个位点在3个绵羊群体中为低度多态，说明这 2 个位点的选择潜力较小。卡方检验结果表明，3个位点在3个绵羊群体中均处于哈代-温伯格平衡状态 (P>0.05)，表明这3个位点在长期的选择过程中已趋于稳定。关联分析结果表明，同一位点在不同绵羊群体中受到的选择压力不一致，g.75132817C>T位点在和田红羊群体中，突变型TT个体产羔数显著高于野生型CC个体，在吐鲁番黑羊群体中，TT个体产羔数高于CC个体，但差异不显著，在阿勒泰羊群体中，TT个体产羔数低于CC个体，说明此位点的突变一定程度上增强和田红羊与吐鲁番黑羊的产羔能力；g.75320579G>A位点在阿勒泰羊中，野生型GG个体产羔数高于于GA个体，说明此位点的突变一定程度上降低阿勒泰羊产羔能力；在和田红羊中，GA个体产羔数高于GG个体的产羔数，说明此位点的突变增强和田红羊的产羔能力；g.75320741G>A位点在和田红羊和阿勒泰羊群体中突变型AA个体产羔数低于野生型GG个体，在吐鲁番黑羊中，AA个体产羔数高于GG个体，说明此突变在一定程度上降低和田红羊和阿勒泰羊的产羔能力，增强吐鲁番黑羊的产羔能力。

不同位点基因型与不同绵羊品种产羔数的关联结果不同，在陈祥等[22]的研究中，黔北麻羊和贵州黑山羊群体中，FSHR基因(第1外显子)突变的不同基因型个体之间产羔数差异不显著，与本研究结果不同。可能是由于地域不同造成的自然选择不同或者是品种不同造成的，绵羊FSHR基因第1外显子和第9外显子的突变与产羔数的关系具有种属差异性。

4 结 论

研究表明FSHR基因g.75132817C>T、g.75320579G>A和g.75320741G>A 3个位点的多态性与阿勒泰羊、吐鲁番黑羊、和田红羊产羔数有关联性，3个位点的突变均导致阿勒泰羊产羔数降低；g.75132817C>T位点突变导致和田红羊和吐鲁番黑羊的产羔数升高，并且显著提高和田红羊的产羔数，说明此位点可作为和田红羊选育的辅助标记；g.75320741G>A位点的突变导致吐鲁番黑羊产羔数升高，g.75320741G>A位点可作为吐鲁番黑羊选育的辅助标记。