干酪乳杆菌LC2W胞外多糖生物合成基因簇启动子的鉴定

杜心恬， 宋 馨， 刘欣欣， 夏永军， 艾连中， 熊智强

上海理工大学医疗器械与食品学院， 上海食品微生物工程技术研究中心， 上海 200093

干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)是一种常见的益生乳酸菌，广泛存在于乳制品、自然界和人体中[1]。其中，LC2W是一株高产胞外多糖(exopolysaccharides, EPS)的干酪乳杆菌，其EPS不仅可以作为食品添加剂改变产品质构，也能作为一种“粘性”发酵剂改善产品风味[2]。LC2W的EPS还具有降血压、肠道菌群维稳和激活免疫应答等益生功效。干酪乳杆菌LC2W中EPS结构解析与产量优化等研究比较深入。例如，AI等完成了LC2W的EPS的分离纯化，解析了其结构[3]和生物合成途径[4]。LI等[2]通过代谢工程方法调控LC2W中EPS合成，使EPS产量提高了75%。

EPS的生物合成一般由eps基因簇控制，包括调控、链长、重复单元合成、聚合和输出等基因[5]。SONG等[6]通过Crispr/Cas9基因编辑技术鉴定出干酪乳杆菌LC2W中3个影响EPS合成的关键基因。但LC2W中EPS生物合成研究仍有欠缺，特别是控制转录起始及速率的重要元件启动子尚未鉴定，其转录调控亟待研究[7]。生物信息学方法可以利用启动子保守序列和转录调控数据库信息，预测启动子位置。RT-PCR[8]和5′-cDNA末端快速扩增技术(5'-RACE)[9]等实验方法可以鉴定启动子区域。本研究通过生物信息学方法预测干酪乳杆菌LC2W中eps基因簇的潜在启动子区域，利用RT-PCR方法鉴定启动子，以期为干酪乳杆菌LC2W的EPS合成转录调控研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1菌株与质粒

本实验所用的菌株干酪乳杆菌LC2W由实验室保藏。

1.1.2试剂与引物

本实验所用的引物由生工生物有限公司合成(表1)。基因组提取试剂盒购自Axygen；RNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；琼脂糖购自生工生物有限公司；Phanta超保真DNA聚合酶购自南京诺唯赞生物科技有限公司； DNA Marker、DNase I(RNA Free)酶试剂盒及反转录试剂盒购自Takara。

1.1.3培养基

MRS培养基：用于培养干酪乳杆菌；胰蛋白胨10 g/L，酵母浸粉5 g/L，牛肉膏10 g/L，葡萄糖20 g/L，柠檬酸铵 2 g/L，磷酸氢二钾 2 g/L，乙酸钠 5 g/L，硫酸镁0.2 g/L，硫酸锰0.04 g/L，吐温80 1 ml/L。固体培养基加琼脂粉20 g/L。

表1 本研究所用的引物

1.1.4仪器与设备

移液枪，购自Eppendorf公司；冷冻离心机，购自Sigma；超微量核酸蛋白定量仪Nanodrop 2000，购自Thermo Fisher；PCR仪、电泳仪和凝胶成像仪，购自Bio-Rad。

1.2 方法

1.2.1基因组抽提

挑取平板划线的干酪乳杆菌LC2W单菌落于MRS液体培养基中活化12 h，以2%的比例接种于5 mL MRS液体培养基，37 ℃静置培养12 h～16 h后，离心收集菌体。根据Axygen基因组提取试剂盒说明书步骤操作，提取LC2W基因组。

1.2.2RT-PCR鉴定共转录单元

将干酪乳杆菌LC2W液体培养至对数生长期，收集菌体，按照天根RNA提取试剂盒说明书步骤操作提取RNA。通过Takara反转录试剂盒合成cDNA，利用cDNA在相邻的基因间隔区进行PCR，筛选干酪乳杆菌eps基因簇中的共转录单元。

以干酪乳杆菌LC2W的DNA、RNA和cDNA为模板，分别与eps基因簇上的所有基因间隔区的引物orf2169-orf2170-F/R、orf2170-orf2171-F/R、orf2171-orf2172-F/R、orf2172-orf2173-F/R、orf2173-orf2174-F/R、orf2174-orf2175-F/R、orf2175-orf2176-F/R、orf2176-orf2177-F/R、orf2177-orf2178-F/R、orf2178-orf2179-F/R、orf2179-orf2180-F/R、orf2180-orf2181-F/R、orf2181-orf2182-F/R、orf2182-orf2183-F/R、orf2183-orf2184-F/R、orf2184-orf2185-F/R、orf2185-orf2186-F/R、orf2186-orf2187-F/R、orf2187-orf2188-F/R、orf2188-orf2189-F/R、orf2189-orf2190-F/R共21对引物进行PCR扩增，其中DNA组为阳性对照，RNA组为阴性对照，cDNA组为实验组。

PCR扩增反应为50 uL体系(表2)，扩增程序如下：94 ℃ 2 min；98 ℃ 10 s；Tm(引物退火温度)30 s；68 ℃，1 min/kb，循环30次；68 ℃ 10 min。PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测条带，筛选共转录单元，鉴定启动子区域。

表2 PCR反应体系

2 结果与讨论

2.1 生物信息学方法预测eps基因簇启动子区域

干酪乳杆菌LC2W前期已完成基因组全测序，将干酪乳杆菌LC2W预测的eps基因簇与乳酸菌中参与EPS生物合成的已知基因进行比对，发现LC2W中eps基因簇由21个基因组成(图1)，且预测得到该基因簇的各基因功能[6](表3)。

eps基因簇通常以多个共转录单元组成，启动子通常位于基因转录起始位点上游的非编码区，自身不转录mRNA[10]。通过对eps基因簇上的共转录单元进行筛选，可以确定启动子存在的位置[8]。启动子存在于每个转录单元的转录起始位点上游，利用NCBI ORFfinder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)预测LC2W中eps基因簇操纵子和CDS(基因编码区)，推测潜在启动子区域(表3)。由于LC2W_2171-LC2W_2175基因功能不明，所以暂未列入预测。结果显示LC2W中eps基因簇预测存在5个操纵子，其余皆为单基因转录单位(图1)。结合基因功能预测结果，通过生物信息学方法分析共得到8个潜在启动子区域，分别命名为P2169-2170、P2179-2180、P2180-2181、P2182-2183、P2183-2184、P2185-2186、P2187-2188、P2189-2190。(图1)

注：操纵子区域为同色系，单基因转录单元为独立色系。图1 干酪乳杆菌LC2W中预测的eps 基因簇及启动子预测

表3 干酪乳杆菌LC2W中eps基因簇中操纵子的预测

2.2 RT-PCR鉴定eps基因簇启动子区域

为验证上述生物信息学的预测，因共转录单元mRNA的连续性，设计了22对基因间隔区间的引物，通过RT-PCR分析证实eps基因簇上的潜在共转录单元。若cDNA与引物的PCR产物有条带，则相邻基因共转录，一般不存在启动子；若无条带，则相邻基因独立转录，是潜在启动子区域。其中，DNA组为阳性对照，RNA组为阴性对照。

RT-PCR结果表明(图2)，干酪乳杆菌LC2W的eps基因簇中存在5个操纵子，其余2个基因皆为单基因转录单位。基因簇上存在个6个启动子区域，分别为P2169-2170、P2172-2173、P2174-2175、P2175-2176、P2185-2186、P2189-2190。与生物信息学方法预测的结果相比，有5个潜在启动子区域P2179-2180、P2180-2181、P2182-2183、P2183-2184和P2187-2188不存在启动子结构，而P2169-2170、P2185-2186、P2189-2190是3个正确的启动子。此外，基因簇上发现了3个未被预测到的启动子P2172-2173、P2174-2175、P2175-2176。不同细菌启动子基因的差异性会影响预测结果，这可能是造成本研究通过RT-PCR鉴定得到的启动子与生物信息学预测结果不同的重要原因[11]。

3 结论

本研究通过生物信息学分析干酪乳杆菌LC2W的eps基因簇，通过基因功能和操纵子的预测分析，推测出8个潜在启动子区域。利用RT-PCR方法筛选eps基因簇中的共转录单元，鉴定出6个启动子区域P2169-2170、P2172-2173、P2174-2175、P2175-2176、P2185-2186、P2189-2190，与预测结果略有差异。启动子是基因表达调控网络的关键元件，本研究干酪乳杆菌LC2W中eps基因簇启动子的鉴定，对后续EPS生物合成转录调控机理研究提供帮助。