NF-κB/COX-2信号通路在宫颈癌中的作用及机制研究

2020-08-31 11:32:23 中国当代医药 2020年20期

黄晶 潘宜云 钟金平 余瑛 廖振蓉 周茂华 黄刚 刘联斌

[摘要]目的 探讨敲减环氧合酶2(COX-2)对宫颈癌Hela细胞系生物学特性的影响及潜在机制。方法 构建稳定转染shRNA-COX-2的宫颈癌Hela细胞,通过CCK-8法检测细胞增殖能力、克隆形成法检测细胞克隆能力、流式细胞术检测细胞凋亡及Transwell检测细胞迁移能力,观察敲减COX-2表达后对细胞生物学功能的影响;通过Western Blot检测p65、p-p65蛋白的表达。结果 转染shRNA COX-2诱导p65及p-p65表达下调,并降低Hela细胞增殖、克隆形成及迁移能力。结论 下调COX-2可能通过调控NF-κB信号通路抑制宫颈癌Hela细胞的恶性生物学特性,从而抑制宫颈癌细胞的生长。

[关键词]宫颈癌;Hela细胞;增殖;克隆形成;质粒

[中图分类号] R737.33          [文献标识码] A          [文章编号] 1674-4721(2020)7(b)-0004-05

Study on the effect and mechanism of NF-κB/COX-2 signaling pathway in cervical cancer

HUANG Jing1   PAN Yi-yun2   ZHONG Jin-ping1   YU Ying1   LIAO Zhen-rong1   ZHOU Mao-hua3   HUANG Gang3   LIU Lian-bin3▲

1. Department of Gynecological Tumor, Ganzhou Cancer Hospital, Jiangxi Province, Ganzhou   341000, China; 2. Department of Chemotherapy, Ganzhou Cancer Hospital, Jiangxi Province, Ganzhou   341000, China; 3. Department of Clinical Laboratory, Ganzhou Cancer Hospital, Jiangxi Province, Ganzhou   341000, China

[Abstract] Objective To investigate the effect and potential mechanism of knocking down cyclooxygenase 2 (COX-2) on the biological characteristics of cervical cancer Hela cell line. Methods Cervical cancer Hela cells stably transfected with shRNA-COX-2 were constructed. Cell proliferation ability was detected by the CCK-8 method, cell cloning ability was detected by the clone formation method, apoptosis was detected by flow cytometry and cell migration ability was detected by Transwell. The effect of knocking down COX-2 expression on cell biological function was observed. The expression of p65 and p-p65 proteins was detected by Western Blot. Results Transfection of shRNA COX-2 induced the down-regulation of p65 and p-p65 expression, and reduced the proliferation, clonal formation and migration ability of Hela cells. Conclusion Down-regulation of COX-2 may inhibit the malignant biological characteristics of cervical cancer Hela cells by regulating the NF-κB signaling pathway, thereby inhibiting the growth of cervical cancer cells.

[Key words] Cervical cancer; Hela cells; Proliferation; Clonal formation; Plasmids

宮颈癌在全世界妇女恶性肿瘤中位居第二,发病率呈逐年上升趋势,年新发病人数约53万,主要发生在发展中国家,西方发达国家宫颈癌发病率的下降得益于宫颈癌筛查的普及[1]。我国宫颈癌约以7.3%速率增长,由于筛查普及不足,多数患者确诊时已属于晚期,治疗效果差,严重威胁生命健康[2]。早期发现及诊断是宫颈癌治疗的关键,宫颈癌前病变及发生发展与人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)持续感染密切相关[3]。炎症因子核因子κB(nuclear factor κB,NF-κB)、环氧合酶(cyclooxygenase,COX-2)在慢性炎症和致癌通路中发挥重要作用[4]。研究指出下降NF-κB的DNA结合活性,减少COX-2蛋白表达可预防肿瘤的出现[5]。NF-κB、COX-2在宫颈癌的作用尚不明确,本研究旨在探讨NF-κB/COX-2信号通路在宫颈癌中的作用及潜在机制,以期为宫颈癌的诊断和治疗提供新的靶标,现报道如下。

1材料与方法

1.1细胞与主要试剂

人宫颈癌Hela细胞系购自中科院上海细胞库;慢病毒载体pLenR-GPH、病毒包装辅助质粒pRsv-REV,pMDlg-pRRE,pMD2G,Transfer Vector、293T细胞、大肠埃希菌菌株DH5α、dsDNA oligo购自Beyotime公司;限制性内切酶购自Takara公司;胎牛血清(FBS)(批号:10270-106)、DMEM培养基(批号:C11995)购自美国Gbico公司;兔抗COX-2(批号:ab120295)购自美国Abcam公司;p65(批号:PA141573)、p-p65(批号:AF2006)购自Affinity公司;羊抗鼠/兔二抗(批号:F2761)购自美国Gibco公司;大提质粒试剂盒购自美国Qiagen公司;LipofectaminTM 2000、胰蛋白酶、Trizol、SYBR购自美国Invitrogen公司;Annexin V-APC凋亡试剂盒购自美国eBioscience美国公司;流式细胞仪(Guava easyCyte HT)购自美国密理博公司。

1.2实验分组

未转染的Hela细胞作为对照(Hela组),转染RNAi阴性对照Scramble的为NC组,此外3组shRNA COX-2稳定转染的Hela细胞分别为Sh1、Sh2及Sh3组,选择其中敲减效率最高的为KD组。

1.3实验方法

1.3.1 RNAi慢病毒载体构建及慢病毒病毒转染Hela细胞  根据Genebank中COX-2序列(PTGS-2,NM_ 000963)为模板选择3段靶序列:RNAi(1)5′-GCTGAATTTAACACCCTCTAT-3′、RNAi(2)5′-CCATTCT CCTTGAAAGGACTT-3′、RNAi(2)5′-CCGGAATTTTT GACAAGAA-3′。同时设计RNAi阴性对照Scramble序列:5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′。再根據以上3段序列设计寡核苷酸序列,该序列中插入Age I、EcoR I酶切位点,每对寡核苷酸序列退火后可形成短发夹结构,其中发夹环为19个碱基组成的小片段DNA双链(表1)。聚合酶链式反应(PCR)鉴定阳性重组子后,送上海领科生物科技有限公司进行测序验证。利用慢病毒载体包装系统,然后共转染293T细胞,转染后8 h然后继续培养48 h后,收集细胞上清液。取对数生长期的Hela细胞,以5×104cell/孔接种于6孔板中,置入37℃ 5%CO2培养箱培养。细胞融合度达到约30%后加入适宜量的病毒,12 h后观察细胞状态:如果没有明显的细胞毒性作用,继续培养24 h后更换培养基;如果有明显的细胞毒性作用,立即更换培养基,感染3 d后荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达。

1.3.2 Western Blot检测蛋白表达  收集慢病毒转染96 h的Hela细胞,提取蛋白并测定浓度。恒流300 mA 150 min条件下湿转法转膜。室温下封闭1 h,加入TBST稀释的COX-2(Abcam,1∶1000),p65(Abcam,1∶1000),p-p65(Abcam,1∶1000),4℃震荡孵育过夜、TBST洗涤后,加入二抗室温孵育2 h。充分洗涤后通过ECL化学发光进行曝光。采用Image J软件计算灰度值。

1.3.3 CCK-8实验检测细胞增殖能力  取对数生长期的各组细胞制备成细胞悬液,计数细胞后种入96孔板细胞密度(约2000个/孔),每组3~5个负孔,共5个96孔板,连续检测5 d,置入37℃ 5%CO2培养箱培养。从铺板后第2天开始,培养终止前24 h,每孔加入10 μl的CCK-8,无需换液,注意尽量避免吹入气泡,2~4 h后,振荡器振荡5~10 min,立即酶标仪450 nm检测OD值,如果空中出现影响测量结果的气泡,用烧热的注射器针头戳破,对数据进行统计绘图。

1.3.4 Transwell实验检测细胞迁移能力  Transwell小室上加入100 μl细胞悬液,下室加入600 μl 30%FBS培养基。37℃培养箱培养,Giemsa染色液染色转移细胞,空气晾干,显微镜拍照。

1.3.5流式细胞仪检测细胞凋亡  收集悬浮细胞离心(2000 r/min离心5 min),用PBS洗涤细胞2次(2000 r/min离心5 min)收集1.5×105细胞,加入500 μl的Binding Buffer悬浮细胞;加入5 μl Annexin V-FITC混匀后,加入5 μl Propidium Iodide,混匀;室温、避光、反应5~15 min;在1 h内,进行流式细胞仪的观察和检测。

1.4统计学方法

采用IBM SPSS 22.0统计学软件进行数据分析,计量资料用均数±标准差(x±s)表示,多组间比较采用单因素方差分析,两组间比较采用t检验,以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1构建shRNA-COX-2稳定转染的Hela细胞

构建三组shRNA-COX-2稳定转染的Hela细胞,Western Blot检测各组COX-2的表达,结果显示,Sh1、Sh2及Sh3组的COX-2表达均低于Hela组及NC组(P<0.05);NC组与Hela组的COX-2比较,差异无统计学意义(t=2.721,P>0.05)。根据敲减结果选择Sh3组作为后续实验细胞株(图1)。

A:Hela细胞中COX-2蛋白表达的相对定量(与Hela组比较,*P<0.05,***P<0.001);B:Western Blot检测COX-2的相对表达

2.2敲减COX-2表达对Hela细胞增殖、克隆能力的影响

通过CCK-8法检测敲减COX-2表达对Hela细胞增殖能力的影响,结果显示,生长72 h时KD组的增殖能力低于NC组,差异有统计学差异(P<0.05);生长96 h时差异更为明显(P<0.05)(图2A);敲减COX-2表达后,KD组克隆细胞克隆形成能力低于NC组,差异有统计学差异(t=4.871,P<0.05)(图2B)。

与NC组比较,*P<0.05,**P<0.01

A:CCK-8法检测Hela细胞增殖;B:Hela细胞克隆形成率

2.3敲减COX-2表达对Hela细胞凋亡与迁移能力的影响

通过Transwell法检测Hela细胞迁移能力,结果显示,KD组的细胞迁移能力明显低于NC组,差异有统计学意义(P<0.001);NC组与Hela组的细胞迁移能力比较,差异无统计学意义(P>0.05)(图3A)。通过Annexin V-PI法检细胞凋亡情况,结果显示,敲减COX-2表达后,KD组与NC组的细胞凋亡率比较,差异无统计学意义(t=0.997,P>0.05)(图3B)。

2.4敲减COX-2表达对Hela细胞NF-κB通路的影响

Western Blot检测NF-κB通路相关蛋白p65及p-p65的表达,当敲减Hela细胞COX-2表达后,KD组的COX-2、p65及p-p65表达均低于NC组,差异有统计学意义(P<0.001)(图4)。

3讨论

HPV持续感染是宫颈癌病变的重要原因,HPV DNA整合发生于宫颈病变早期,病毒致癌基因E6和E7活化,E2抑制内源性E6基因表达并诱导宫颈细胞肿瘤坏死因子-α(TNF-α)介导的NK-κB激活[6]。NF-κB通路不仅是炎症反应的关键信号,其异常活化可导致哮喘、肠炎及多种肿瘤疾病的发生。此外,NF-κB通路在宿主的先天性和适应性免疫反应中发挥重要作用[7]。早期病变时,NF-κB的激活抑制HPV持续感染状态。在发展成高度上皮内瘤变和宫颈癌的进程中,发挥协同作用促进病变[8-9]。实体瘤中NF-κB自身基因突变少见,但上游信号分子(如RAS、EGFR、PGF、HER2)的突变与活化NF-κB信号传导有关[10]。NF-κB可以通过端粒酶调控增殖调节基因,如cyclin D1和c-myc,参与细胞恶性转移、血管内皮生长因子(VEGF)依赖性的血管生成和细胞永生基因的转录激活[11-12]。NF-κB激活还可以诱导激活胞嘧啶脱氨酶和APOBEC蛋白的表达,进而间接或直接参与宫颈癌的发生[13]。

COX-2作为前列腺素E2合成通路上的关键酶,在细胞凋亡、血管生成、免疫抑制及细胞迁移等过程中发挥重要作用,与宫颈癌发生进展密切相关[14]。COX-2的活性受到NF-κB的调节,在非小细胞癌中,NF-κB激活上调COX-2的表达[15]。前列腺素E2的抑制剂hyaluronan抑制白介素-1(IL-1)誘导的NF-κB活性,前列腺素E2表达和NF-κB活性相关[16]。NF-κB调控多种涉及转移侵袭的基因表达,包括基质金属蛋白酶9(MMP9)和VEGF,MMP9参与基质胶原降解进而影响了癌细胞转移和侵袭,激活NF-κB信号可以诱导MMP9表达促进细胞侵袭[17-18]。最近研究显示姜黄素可以通过下降NF-κB的DNA结合活性,减少COX-2蛋白来调控癌细胞的增殖与凋亡[19-20]。

本研究通过构建稳定表达shRNA-COX-2的Hela细胞,敲减COX-2表达后观察对Hela细胞生物学功能的影响,结果显示,敲减COX-2后显著抑制宫颈癌Hela细胞的增殖、克隆形成及迁移能力,但并未明显影响Hela细胞凋亡能力,提示COX-2是Hela细胞恶性表型的关键基因。进一步探究COX-2的调控作用,抑制p65及p-p65表达,介导NF-κB信号通路发挥作用。但NF-κB/COX-2信号通路如何在宫颈癌Hela细胞中发挥关键作用,具体上下游调控机制有待于更深入的研究。

综上所述,下调COX-2可能通过NF-κB通路抑制宫颈癌Hela细胞的增殖、克隆能力,并降低细胞的侵袭迁移作用,有利于深入了解其作用机制,为宫颈癌的精准个体化治疗提供方向。

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(收稿日期:2020-01-16)