岭南山竹子醇提物对LPS致RAW264.7细胞炎性损伤的保护作用研究

黄雷 刘美琼 张小曼 苏少锋 邹小琴 钟小斌 冯洁

中圖分类号 R285.5 文献标志码 A 文章编号 1001-0408（2020）14-1719-07

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2020.14.11

摘 要 目的：探讨岭南山竹子70%乙醇提取物（GOEE）对脂多糖（LPS）致RAW264.7细胞炎性损伤的保护作用及其潜在分子机制。方法：取岭南山竹子果皮用70%乙醇回流提取，制得GOEE。采用Folin-Ciocalteau法和紫外-可见分光光度法分别测定GOEE中总多酚和总黄酮的含量。采用MTT法检测不同剂量GOEE的细胞毒性;以LPS诱导小鼠单核巨噬细胞RAW264.7建立炎症模型，分别以地塞米松、N-乙酰基-L-半胱氨酸为阳性对照，采用Griess法和2′，7′-二氯荧光素法检测细胞培养液中一氧化氮（NO）和细胞中活性氧（ROS）的含量;采用酶联免疫吸附测定（ELISA）法测定细胞培养液中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素6（IL-6）和IL-1β水平;采用Western blotting法测定细胞中p65蛋白（p65）、磷酸化p65（p-p65）、核因子κB抑制蛋白α（IκBα）、磷酸化IκBα（p-IκBα）、血红素加氧酶-1（HO-1）以及细胞核内核因子E2相关因子2（NRF2）蛋白的表达水平。结果：GOEE中总多酚与总黄酮的含量分别为（20.191±1.264）、（12.571±0.020）mg/g。当剂量≤500 μg/mL时，GOEE对RAW264.7细胞存活率无显著影响（P>0.05）。与对照组比较，LPS模型组NO、ROS含量，TNF-α、IL-6、IL-1β水平，p-p65/p65和p-IκBα/IκBα比值以及NRF2蛋白的表达水平均显著升高（P<0.05或P<0.01）。与LPS模型组比较，阳性对照组和GOEE各处理组细胞NO（除GOEE 50 μg/mL处理组外）、ROS含量，TNF-α、IL-6、IL-1β水平以及p-p65/p65和p-IκBα/IκBα比值均显著降低，HO-1、NRF2蛋白的表达水平均显著升高（P<0.05或P<0.01）。结论：GOEE可通过抑制炎症反应、抑制核因子κB通路磷酸化、促进NRF2蛋白入核等途径来减轻LPS诱导的小鼠巨噬细胞炎性损伤。

关键词 岭南山竹子;果皮;醇提物;抗炎作用;核因子κB;核因子E2相关因子2;小鼠巨噬细胞;RAW264.7

Study on Protective Effects of the Ethanol Extract of Garcinia oblongifolia on LPS-induced RAW264.7 Cell Inflammatory Injury

HUANG Lei1，2，LIU Meiqiong2，ZHANG Xiaoman2，SU Shaofeng2，ZOU Xiaoqin3，ZHONG Xiaobin1，FENG Jie2 （1. Dept. of Pharmacy， Langdong Hospital of Guangxi Medical University， Nanning 530029， China; 2. TCM Teaching and Research Section， School of Pharmaceutical Sciences， Guangxi Medical University， Nanning 530021， China; 3. Dept. of Scientific Research， the First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University， Nanning 530021， China）

ABSTRACT   OBJECTIVE： To investigate the anti-inflammatory activity of 70%ethanol extracts from Garcinia oblongifolia （GOEE） on LPS-induced RAW264.7 cells and its potential molecular mechanism. METHODS： GOEE was obtained after the fresh G. oblongifolia epicarp refluxed with 70% ethanol. The contents of total phenol and total flavonoids were determined by Folin-Ciocalteau assay and UV spectrophotometer. MTT assay was used to detect the cytotoxicity of different doses of GOEE. The inflammatory model was induced in RAW264.7 cells by lipopolysa- ccharide （LPS）. Using dexamethasone and N-acetyl-L-cysteine as positive control， Griess assay and 2′， 7′-dichloro- fluorescein assay were used to detect the contents of NO in cell culture medium and ROS in cells. The levels of TNF-α， IL-6， and IL-1β in cell culture medium were measured by ELISA. The protein expression of p65， p-p65， IκBα， p-IκBα， HO-1 in cells and NRF2 in nucleus were determined by using Western blotting assay. RESULTS： The contents of total phenol and flavonoids in GOEE were （20.191±1.264）and （12.571±0.020）mg/g， respectively.  At the concentration below 500 μg/mL， GOEE had no significantly effect on survival rate of RAW264.7 cells （P>0.05）. Compared with control group， the contents of NO and ROS， the levels of TNF-α， IL-6 and IL-1β， ratio of p-p65 to p65， ratio of p-IκBα to IκBα， protein expression of NRF2 were increased significantly in LPS model group （P<0.05 or P<0.01）. Compared with LPS model group， the contents of NO （except for GOEE 50 μg/mL group） and ROS， the levels of TNF-α， IL-6 and IL-1β， ratio of p-p65 to p65 and ratio of p-IκBα to IκBα were decreased significantly in GOEE groups and positive control groups， while protein expression of HO-1 and NRF2 were increased significantly （P<0.05 or P<0.01）. CONCLUSIONS： GOEE attenuates LPS-induced macrophages inflammation injury by inhibiting the inflammatory response and the phosphorylation of NF-κB pathway， promoting NRF2 protein transportation to the nucleus.

KEYWORDS   Garcinia oblongifolia; Epicarp; Ethanol extract; Anti-inflammatory effect; NF-κB; NRF2; Mice macrophage; RAW264.7

炎症是机体抵御感染和组织损伤的一种防御机制，许多慢性炎症性疾病（如糖尿病、动脉粥样硬化等）可能是由于过度的炎症反应所引起的[1]。当各种内在或外在的刺激导致巨噬细胞过度活化时，炎症细胞被激活并维持免疫反应。因此，调节巨噬细胞活化可能将有利于许多炎症性疾病的治疗。脂多糖（LPS）是革兰氏阴性菌细胞壁的内毒素，通常用于诱导小鼠单核巨噬细胞以建立炎症模型[2]。LPS还可使核因子κB（NF-κB）活化，活化的NF-κB可进一步诱导促炎细胞因子的产生，包括肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素6（IL-6）和IL-1β。而促炎细胞因子能够刺激机体产生过量的活性氧（ROS），从而打破机体内氧化与抗氧化之间的平衡，造成氧化应激[3]。若机体长时间处于氧化应激状态，可进一步诱导细胞凋亡、组织坏死[4]。核因子E2相关因子2（NRF2）是调节氧化应激的关键蛋白，有文献报道，激活NRF2可保护机体免受急性肺损伤、急性肝衰竭等各种炎症性疾病的侵害[5-6]。因此，NRF2与NF-κB一同作为炎症性疾病的潜在治疗靶标引起了学者的广泛关注[7]。

岭南山竹子（Garcinia oblongifolia Champ. ex Benth.）属于藤黄科藤黄属植物，主要分布于我国广西、广东地区。据文献报道，从岭南山竹子的树皮中分离出来的Garcinone C、Griffipavixanthone、Oblongifolin M、Norcowanin等化合物具有抗肿瘤、抗糖尿病和抗病毒等活性[8-11]。然而，国内外现有研究主要集中于岭南山竹子的树皮与树叶，且多为简单的活性成分研究。由于民间主要是以岭南山竹子的果皮入药以消炎镇痛，有关该药果皮化学成分的研究仅有1篇报道[12]，而有关其药理作用尤其是抗炎抗氧化活性的研究等尚未见相关报道。为此，本研究以LPS诱导小鼠单核巨噬细胞RAW264.7建立炎症细胞模型，通过检测一氧化氮（NO）、ROS的含量以及促炎细胞因子、炎症介质等炎性靶标表达水平的变化，初步探讨岭南山竹子70%乙醇提取物（GOEE）的抗炎活性及其潜在的分子机制，旨在为治疗炎症性疾病提供更多的候选药物。

1 材料

1.1 仪器

EL204型电子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）;TV-1901型紫外-可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）;WIX-miniPRO4型迷你垂直电泳槽（北京韦克斯科技有限公司）;Odyssey型双色红外激光成像系统（美国LI-COR公司）;SpectraMax Plus384型连续光谱扫描式酶标仪（美国Molecular Devices公司）;SynergyTM H1全功能酶标仪（美国BioTek公司）;R-1001N型旋转蒸发仪（郑州长城科工贸易有限公司）;ACB-4A1型超净工作台（新加坡ESCO公司）;3111型CO2培养箱（美国Thermo Fisher Scientific公司）。

1.2 药品与试剂

新鲜岭南山竹子于2017年7月采集于广西壮族自治区北海市，经广西医科大学冯洁教授鉴定为藤黄科藤黄属岭南山竹子（G. oblongifolia Champ. ex Benth.）的新鲜果实。药材标本（编号：GB20170728）保存于广西医科大学药学院。

LPS（美国Sigma公司，批号：L2880）;NO试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号：20181007）;TNF-α、IL-6、IL-1β酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒（上海源叶生物科技有限公司，批号：CK-E20220M、CK-E20012M、CK-E20533M）;兔源磷酸化p65（p-p65）、磷酸化核因子κB抑制蛋白α（p-IκBα）多克隆抗体（美国ABclonal Technology公司，批号：AP0124、AP0614）;兔源IκBα、p65、NRF2、血红素加氧酶1（HO-1）、核纤层蛋白B（Lamin B）多克隆抗体和小鼠源甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）单克隆抗体（美国Proteintech Group公司;批号：10268-1- AP、10745-1-AP、16396-1-AP、10701-1-AP、12987-1-AP、6004-1-1g）;胎牛血清（美国Gemini公司，批号：A87F82H）;高糖DMEM培养基（美国Gibco公司，批号：8118048）;兔源免疫球蛋白G（IgG）（H+L）荧光二抗、小鼠源IgG （H+L）荧光二抗（美国CST公司，批号：5366P、5257P）;N-乙酰基-L-半胱氨酸（NAC）对照品（抗氧化剂，纯度：≥99%）、ROS试剂盒[含2′，7′-二氯二氫荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）等试剂]、胞核胞浆蛋白抽提试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒、Loading Buffer上样缓冲液（碧云天生物技术研究所，批号：S0077、S0033、P0027、P0012、P0015）;地塞米松磷酸钠注射液（DEX，阳性对照，国药集团容生制药有限公司，批号：1801207，规格：1 mL ∶ 2 mg）;MTT、二甲基亚砜（DMSO）、芦丁对照品（纯度：≥99%）、青链霉素双抗（北京索莱宝科技有限公司，批号：M8180、D8370、YZ-10080、20180418）;没食子酸对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110831- 201906，纯度：≥99%）;其余试剂均为分析纯，水为超纯水。

1.3 细胞株

小鼠单核巨噬细胞RAW264.7购自中国科学院上海细胞库。

2 方法

2.1 GOEE的制备

取新鲜岭南山竹子果皮（80 g）切成片，用70%乙醇（0.8 L）回流提取3次，每次2.5 h。将提取液过滤并减压浓缩后，冷冻干燥，即得到GOEE冻干品5.26 g，得率为6.58%。

2.2 GOEE中总多酚与总黄酮的含量测定

采用Folin-Ciocalteau法[13]测定GOEE中的总多酚含量，以没食子酸为指标，结果以没食子酸含量表示;采用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH法[14]测定GOEE中总黄酮的含量，以芦丁为指标，使用紫外-可见分光光度计在500 nm波长处检测样品含量，方法学考察内容及其结果见相关文献[13-14]。每样品均重复测定3次。

2.3 细胞培养

将对数生长期的细胞接种于含10%胎牛血清、1%青链霉素双抗的高糖DMEM培养基中，并置于5%CO2、37 ℃的培养箱中培养（培养条件下同）。

2.4 GOEE对LPS诱导RAW264.7细胞的毒性研究

采用MTT法检测。取对数生长期的RAW264.7细胞以5×104个/mL接种于96孔板中，每孔100 μL。将细胞随机分为对照组（0.5%DMSO）、LPS模型组（1 μg/mL，剂量设置参考前期预试验结果，下同）和GOEE处理组（15.625、31.25、62.5、125、250、500、1 000 ?g/mL GOEE+1 μg/mL LPS，GOEE以生药量计，剂量设置参考前期预试验结果），每组设4个复孔。除对照组外，其余各组均与LPS共孵育30 min后，再与药物混合培养。培养24 h后，每孔加入MTT溶液（5 mg/mL）20 ?L，培养4 h，吸弃上清液，每孔加入DMSO 150 ?L，避光振摇10 min，采用连续光谱扫描式酶标仪在490 nm波长处测量各孔的吸光度值，并计算各组细胞的存活率：细胞存活率（%）=试验组吸光度值/对照组吸光度值×100%。上述试验重复3次。

2.5 NO含量检测

采用Griess法检测。取对数生长期的RAW264.7细胞以4×105个/mL接种于96孔板中，每孔100 μL。将细胞随机分为对照组（0.5%DMSO）、LPS模型组（1 μg/mL）、DEX处理组（阳性对照，0.2 μg/mL DEX+1 μg/mL LPS，DEX剂量设置参考前期预试验结果，下同）和GOEE处理组（50、100、150、200、300 μg/mL GOEE+1 μg/mL LPS，GOEE剂量参考“2.4”项下结果），每组设4个复孔。按“2.4”项下方法培养24 h后，收集各孔细胞培养液，以1 000 r/min离心5 min，取上清液，采用连续光谱扫描式酶标仪于550 nm波长处检测细胞培养液中NO的含量。严格按照试剂盒说明书操作，上述试验重复3次。

2.6 ROS含量检测

采用2′，7′-二氯荧光素（DCF）法检测。取对数生长期的RAW264.7细胞以4×105个/mL接种于96孔板中，每孔100 μL。将细胞随机分为对照组（0.5%DMSO）、LPS模型组（1 μg/mL）、NAC处理组（抗氧化剂，10 mmol/L NAC+1 μg/mL LPS，NAC剂量设置参考前期预试验结果）和GOEE处理组（50、100、150、200、300 μg/mL GOEE+1 μg/mL LPS），每组设4个复孔。按“2.4”项下方法培养24 h后，吸弃培养液，将细胞与DCFH-DA（10 mmol/L）100 μL孵育30 min，采用全功能酶标仪于激发波长488 nm、发射波长525 nm处检测ROS与DCFH-DA反应产物（DCF）的荧光强度，并以此表示ROS的含量。严格按照试剂盒说明书操作，上述试验重复3次。

2.7 TNF-α、IL-6、IL-1β水平检测

采用ELISA法检测。取对数生长期的RAW264.7细胞以2×105个/mL接种于6孔板中，每孔1 mL。将细胞随机分为对照组（0.5%DMSO）、LPS模型组（1 μg/mL）、DEX处理组（0.2 μg/mL DEX+1 μg/mL LPS）和GOEE处理组（100、200、300 μg/mL GOEE+1 μg/mL LPS，GOEE剂量参考前文结果，下同），每组设4个复孔。按“2.4”项下方法培养24 h后，收集各孔细胞培养液，以1 000 r/min离心5 min，取上清液，采用ELISA法以连续光谱扫描式酶标仪于450 nm波长处检测细胞培养液中TNF-α、IL-6、IL-1β水平。严格按照试剂盒说明书操作，上述试验重复3次。

2.8 相关蛋白表达水平检测

采用Western blotting法检测。取对数生长期的RAW264.7细胞以4×105个/mL接种于96孔板中，每孔100 μL。将细胞随机分为对照组（0.5%DMSO）、LPS模型组（1 μg/mL）、DEX处理组（0.2 μg/mL DEX+1 μg/mL LPS;检测NRF2信号通路相关蛋白HO-1、NRF2表达时不设该组）和GOEE处理组（100、200、300 μg/mL GOEE+1 μg/mL LPS），每组设4个复孔。培养1 h后，吸弃培养液。分别按试剂盒说明书提取细胞总蛋白（用以检测p-p65、p65、p-IκBα、IκBα、HO-1蛋白的表达）和细胞核蛋白（用以检测NRF2蛋白的表达），用BCA蛋白浓度测定试剂盒进行蛋白浓度测定，以磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）稀释至相应浓度。取上述蛋白，加入5×Loading Buffer上样缓冲液适量，煮沸变性;取变性蛋白样品50 μg，于80 V条件下行10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳后于100 mA下濕法转膜，用5%脱脂奶粉室温封闭1 h，然后分别加入p-p65抗体（1 ∶ 500）、p-IκBα抗体（1 ∶ 500）、p65抗体（1 ∶ 1 000）、IκBα抗体（1 ∶ 1 000）、NRF2抗体（1 ∶ 500）、HO-1抗体（1 ∶ 1 000）、Lamin B抗体（1 ∶ 1 000）、GAPDH抗体（1 ∶ 3 000），4 ℃孵育过夜;用TBST溶液清洗10 min×3次，加入相应二抗（除GAPDH为小鼠源二抗外，其余均为兔源二抗，稀释度均为1 ∶ 10 000），室温下避光孵育1 h，以TBST溶液清洗10 min×3次。于双色红外激光成像系统上成像，并通过Image J2 v5.2.5软件分析，以p-p65和p65、p-IκBα和IκBα灰度值的比值（p-p65/p65、p-IκBα/IκBα比值）来表示p65、IκBα的磷酸化水平，以目标蛋白与内参（HO-1以GAPDH为内参，NRF2以Lamin B为内参）的灰度值比值来表示其表达水平。上述试验重复3次。

2.9 统计学方法

采用SPSS 17.0软件对数据进行统计分析。计量资料以x±s表示，采用单因素方差分析进行多组间比较，采用LSD-t检验进行组间两两比较。P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 总多酚和总黄酮的含量测定结果

以没食子酸当量计算GOEE中总多酚的含量，根据标准曲线方程Y=0.111 6X+0.018 0（R 2=0.999 0）计算出总多酚含量为（20.191±1.264）mg/g（n=3）。以芦丁当量计算GOEE中总黄酮的含量，根据标准曲线方程Y=0.012 7X-0.017 6（R 2=0.999 4）计算出总黄酮含量为（12.571±0.020）mg/g（n=3）。

3.2 GOEE对LPS诱导RAW264.7细胞存活率的影响

LPS模型组细胞存活率与对照组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。与对照组比较，GOEE 1 000 ?g/mL组细胞存活率显著降低（P<0.01），而当GOEE剂量≤500 ?g/mL时，各剂量组细胞存活率与对照组比较差异均无统计学意义（P>0.05），详见表1。根据上述结果，本研究选择GOEE剂量范围为0～500 ?g/mL进行后续试验。

3.3 GOEE对LPS诱导RAW264.7细胞NO、ROS含量的影响

LPS模型组细胞培养液中NO的含量约为对照组的6.09倍，组间比较差异有统计学意义（P<0.01）;与LPS模型组比较，DEX处理组和GOEE 100、150、200、300 μg/mL处理组细胞培养液中NO的含量均显著降低（P<0.05），且随着剂量的增加，NO含量有减少的趋势。与对照组比较，LPS模型组细胞中ROS的含量显著升高（P<0.01）;与LPS模型组比较，NAC处理组与GOEE各处理组ROS的含量均显著降低（P<0.05或P<0.01），详见表2。

3.4 GOEE对LPS诱导RAW264.7细胞TNF-α、IL-1β、IL-6水平的影响

与对照组比较，LPS模型组细胞培养液中TNF-α、IL-6、IL-1β水平均显著升高（P<0.05）。与LPS模型组比较，DEX处理组和GOEE各处理组细胞培养液中TNF-α、IL-6、IL-1β水平均显著降低（P<0.05），详见表3。

3.5 GOEE对LPS诱导RAW264.7细胞NF-κB活化的影响

与对照组比较，LPS模型组细胞中p-p65/p65和p-IκBα/IκBα比值均显著升高（P<0.01）;与LPS模型组比较，DEX处理组和GOEE各处理组细胞中p-p65/p65和p-IκBα/IκBα比值均显著降低（P<0.05或P<0.01），详见图1A、表4。

3.6 GOEE对LPS诱导RAW264.7细胞NRF2、HO-1 蛋白表达的影响

与对照组比较，LPS模型组细胞核中NRF2蛋白的表达水平显著升高（P<0.05）;与LPS模型组比较，GOEE各处理组细胞中HO-1蛋白和细胞核中NRE2蛋白的表达水平均显著升高（P<0.05或P<0.01），详见图1B、表4。

4 讨论

岭南山竹子是一种民间传统用药，主要用于炎症性不适。其相关文献报道多集中于其树皮及树叶，但民间多用果皮入药。为此，本文主要研究了GOEE在LPS诱导RAW264.7细胞中的抗炎药理活性及其潜在分子机制。

炎症反应通常由NO、ROS和炎症细胞因子（包括TNF-α、IL-1β和IL-6）等介导，而炎症细胞因子受NF-κB信号通路的调节。在正常情况下，NF-κB以异二聚体形式与IκBα结合于细胞质中;LPS能够激活NF-κB信号通路，导致IκBα降解，之后NF-κB易位至细胞核诱导炎症[15]。因此，通过抑制IκBα降解来下调NF-κB的表达可能是抗炎药物的研究路线之一。据报道，NRF2信号通路与NF-κB通路具有交叉效应，炎症产生的过量ROS会导致氧化应激，而NRF2信号通路是抗氧化应激反应中最重要的途径，该通路被激活后可诱导抗氧化蛋白HO-1等产生，以对抗机体的氧化应激，从而保护正常细胞免受氧化应激的损害[16]。

NO是炎症反应中传递信号的信息分子，是与炎症疾病有关的炎症介质之一[17]。本研究结果表明，GOEE显著抑制了NO的产生，表明了GOEE能够通过阻断炎症信号的传递来发挥抗炎作用。在LPS诱导的RAW264.7细胞炎症模型中，包括TNF-α、IL-1β和IL-6在内的促炎细胞因子的水平均显著升高，提示其促进了炎症的发展。因此抑制促炎细胞因子的产生是治疗炎症性疾病的主要策略之一，这些炎症因子的表达主要受NF-κB转录因子调控。本研究首先通过MTT法筛选出安全剂量范围，从此范围中根据预试验结果设置给药剂量，并以DEX作为抗炎研究的阳性对照，以NAC作为ROS测定的阳性對照。由于DEX对NRF2信号通路无影响，因此在进行抗氧化研究时未设DEX组。本研究结果表明，GOEE可抑制NF-κB中的关键蛋白IκBα和p65的磷酸化，从而抑制NF-κB信号通路的表达及其在下游转录的促炎细胞因子表达。有研究表明，在LPS诱导的肺部炎症中，NRF2基因敲除小鼠的TNF-α、IL-1β和IL-6的表达高于未敲除小鼠;进一步研究表明，NRF2基因敲除小鼠的NF-κB p65与DNA有更强的结合活性[18]。说明NRF2编码基因的缺失能够加重炎症反应。HO-1的上调会促进其衍生代谢产物（如CO、胆红素等）的产生，这些代谢产物不仅具有抗氧化活性，还具有抗炎作用[19-21]。本研究结果表明，GOEE抑制了ROS和NO的产生。本研究检测了细胞核内NRF2的表达情况，发现LPS能够诱导NRF2入核，GOEE能进一步促进NRF2入核，并且上调NRF2调控的抗氧化酶HO-1的表达。这表明GOEE还能通过上调NRF2与HO-1抑制了LPS诱导的巨噬细胞炎症反应。同时，本研究通过测量GOEE中总黄酮与总多酚的含量发现，GOEE中总多酚的含量远高于总黄酮的含量。酚羟基中的邻位酚羟基易被氧化，是良好的抗氧化剂;同时，酚羟基还可以提供活泼氢，使活性氧等自由基灭活，本身被氧化形成含有邻二酚结构的自由基而稳定存在[22]。因而推测可能是GOEE中多酚类物质发挥了抗氧化与抗炎作用，但有待后续研究予以确证。

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（收稿日期：2019-12-13 修回日期：2020-05-13）

（编辑：罗 瑞）