超高效液相色谱-串联质谱法测定12种食品中的阿维菌素、伊维菌素药物残留

高洋洋 李小丽 赵媛媛 何 悦 刘 鑫

（1.北京市西城区疾病预防控制中心 北京 100120；2.北京海关技术中心食品实验室）

1 前言

阿维链霉菌发酵时产生的大环内酯类杀虫剂阿维菌素和伊维菌素属于阿维菌素类药物。作为新型农畜两用药，阿维菌素类药物具有高选择性和高杀虫活性，在叶螨虫、菜青虫、蚜虫的防治及猪、牛、马、羊等寄生虫的驱除领域应用广泛。该药物为脂溶性物质，喷洒后易被有机溶剂、沉积颗粒及土壤吸收，产生较大危害。对于牲畜，无论以涂抹、注射、口服或作为饲料添加剂等途径使用，吸收和利用率均较高，易分布于动物肌肉和肝脏中，持续时间较长且消除缓慢。该类药物的不规范使用和食物链富集，易引发运动失调、呼吸缓慢、中枢神经系统中毒等症状，甚至致人死亡，对人类健康造成严重威胁[1-3]。

世界卫生组织（WHO）已将阿维菌素类药物的毒性分级标准确定为高毒性，许多国际组织和国家对阿维菌素类残留量进行限制，例如，欧盟规定蔬菜、水果及谷物中最大残留限量（MRL）为20 μg/kg，各种动物组织中为15 μg/kg；日本列表规定梨中的MRL为20μg/kg，水产品中为5μg/kg；美国规定肉类中MRL为 20 μg/kg；我国规定鸭梨、橘子的 MRL 为 20 μg/kg，绿叶蔬菜为50 μg/kg；早在1992年，中国台湾地区规定动物组织中伊维菌素最高残留量为150 μg/kg；2003年，中国香港地区规定牛肝中伊维菌素的MRL为 100 μg/kg[4-8]。

目前，阿维菌素、伊维菌素的检测方法主要包括酶联免疫法[9-11]、液相色谱-荧光法[12-14]、液相色谱-紫外法[15]、液相色谱-质谱法等[16-20]。其中，酶联免疫法检测速度快、费用低廉，适合大批量样品的初筛，但试验流程烦琐，特异性和灵敏性有待进一步提高。液相色谱的荧光法和紫外法需要将样品衍生，存在基质干扰，不适合痕量检测。近年来，随着UPLC-MS/MS的发展和普及，这种方法无需衍生、省时省力、灵敏度高，可有效利用物质的结构信息，准确定性定量。

现有的阿维菌素、伊维菌素文献中的基质种类大多集中在简单的水果、蔬菜和肌肉组织中，几乎没有能够同时满足多种类型食品的检测方法。本文涉及的特殊基质包括：含有油脂和色素的辣椒、含有脂肪和甾醇的板栗、含有蛋白质和脂肪的牛肉和牛肝。本文通过对提取溶剂的选择、亲水亲油平衡（HLB）固相萃取净化方法的选择、色谱质谱方法的优化的研究，使本法与现有文献中的方法相比，操作简便，节省试剂，能够满足大批量食品中阿维菌素、伊维菌素残留检测的要求。外法定量后回收率较高，检出限均可达到2.0 μg/kg，试验数据表明方法的灵敏度较高，重复性好，结果满意。

2 材料与方法

2.1 材料与试剂

乙腈、甲醇、乙酸乙酯、甲酸、乙酸铵（色谱纯，Fisher公司）；无水硫酸钠（分析纯，国药集团化学试剂北京有限公司）；阿维菌素和伊维菌素标准品(纯度均＞99%，德国Dr.Ehrenstorfer GmbH公司）；试验用水均为超纯水（Millipore系统制造）。

2.2 仪器与设备

高速冷冻离心机（美国贝克曼）；吹氮仪（上海乔跃电子科技有限公司）；超声波振荡器（上海左乐仪器有限公司）；Hypersil Gold C18色谱柱（美国Thermo公司），高效液相色谱串联质谱仪（型号为Thermo ACCELA+TSQ QUANTUM ACCESS）；固相萃取柱（Waters公司）。

2.3 标准溶液配制

称取适量阿维菌素和伊维菌素用甲醇稀释成100 mg/mL标准储备液，置于棕色容量瓶中，放于-18℃冰箱中避光保存。吸取适量100 mg/mL标准储备液用甲醇稀释成100 μg/mL标准工作液，放于4℃冰箱中避光保存。标准曲线的配制：移取适量100mg/mL标准工作液，流动相定容，配制成浓度为1.25、2.5、5.0、10.0、15.0、20.0、30.0 ng/mL 的阿维菌素、伊维菌素标准工作曲线。

2.4 样品前处理

2.4.1 提取

在50 mL的塑料离心管中准确称取2.0 g样品，加入10 mL乙腈，再加入2 g无水硫酸钠，充分混匀，在超声波振荡器中提取20 min后，在3 000 r/min的转速下涡旋振荡1 min，选用高速冷冻离心机调节温度为4℃，8000r/min转速下离心10min，吸取5mL上清液，置于水浴吹氮仪上45℃吹至近干，然后加入5 mL 甲醇-水溶液（50∶50，V/V）待净化。

本次研究发现，相比对照组，研究组治疗有效率对比无显著差异，P＞0.05，且研究组患者生活质量指标改善情况更为明显，P＜0.05。分析原因：在MRI影像辅助下实施夹脊穴深刺主要具有以下优势：首先，可在MR成像辅助下，对病灶位置及腰椎情况进行有效观测，并可实现对夹脊穴的准确定位，确保治疗准确性；其次，通过MRI成像技术，可对治疗中针刺深度实现准确把握，在适宜穴位深度实施治疗，确保治疗有效性[4-5]。

2.4.2 净化

分别加入3.0 mL甲醇和3.0 mL水活化固相萃取柱（规格为60 mg，3 cc），待净化溶液以小于2 mL/min的流速通过，再加入5.0 mL超纯水洗涤固相萃取柱，吹干。用5.0 mL乙酸乙酯洗脱，调整吹氮仪温度为45℃，吹至近干，最后，加入1.0 mL甲醇-水-甲酸溶液（60∶40∶0.1%，V/V/V）混匀并定容，用 0.2 μm Whatman滤膜过滤定容液，转移至进样小瓶待测。

2.5 色谱条件

选用美国Thermo公司Hypersil Gold C18型号色谱柱（规格为 1.9 μm，50 mm×2.1 mm）；A 相：5 mmol乙酸铵溶液+0.1%甲酸；B 相：甲醇；进样体积：10 μL；柱温设定为35℃，梯度洗脱程序详见表1。

表1 液相色谱梯度洗脱条件

2.6 质谱条件

设定正离子模式电离；喷雾电压为4 000 V；离子传输毛细管温度为270℃；辅助气压力为10 arb；鞘气压力为30 psi（206.84 Kpa）；碰撞气体为氩气；检测模式为选择反应监测模式（SRM）。

以流动注射的方式将浓度为200 μg/L的阿维菌素和伊维菌素分别进行质谱参数的优化和调谐，所得质谱参数详见表2。

表2 阿维菌素和伊维菌素质谱参数

3 结果与讨论

3.1 提取溶剂的选择

阿维菌素、依维菌素为脂溶性化合物，难溶于水，微溶于石油醚、正己烷，易溶于甲醇、乙腈、丙酮、乙酸乙酯。本文比较了甲醇、乙腈和丙酮3种溶剂的提取效果，试验结果显示，不同基质的样品，提取效果不同。辣椒、芥蓝和紫苏含有色素，丙酮提取时，提取液颜色较重；果汁为水溶性液体，易与甲醇互溶，加入2 g无水硫酸钠后，分层效果较差；牛肉和牛肝中含有大量脂肪和蛋白，乙腈可沉淀蛋白且避免乳化。综上所述，本试验选择乙腈作为提取溶剂。

3.2 超声提取时间的选择

本文选择阴性生菜样品，加入10 μg/kg的2种标准混合溶液，放入超声波振荡器中，设定超声时间为20、30、40 min，比较提取差别。结果表明，3种超声时间的测定结果没有明显差别，为省时节电，选择超声时间为20 min。

3.3 净化步骤注意事项

测定绿色蔬菜和红色辣椒时，提取液中的色素是检测过程中的主要干扰物质，应用固相萃取法可有效去除色素。Oasis HLB固相萃取柱具有较高吸附容量和良好化学稳定性，柱床干涸时对回收率影响较小。使用过程中需要控制流速小于2 mL/min；上样前、洗脱前在负压条件下用机械泵抽干柱内水分；控制水浴温度不高于45℃，严格把握氮吹时间，近干即可停止，及时定容。

3.4 色谱条件优化

质谱技术可将目标物质分成不同的通道检测，各组分互不干扰，利用液相色谱技术分离目标物质与杂质是液质联用仪检测的前提和基础，更是优化方法的重要步骤之一。其优化过程包括：根据化合物的理化特性选择合适的色谱柱；尝试不同的流动相溶液；比较等度和梯度方法的分离差异；检测实际样品进一步优化；排除复杂基质干扰等。阿维菌素和伊维菌素为弱极性物质，易在反相色谱柱中保留，故选择Thermo Hypersil Gold C18色谱柱。质谱电离的影响因素很多，流动相中增加乙酸铵缓冲盐可提高分离度，且有利于得到[M+NH4]+离子。正离子模式下，加甲酸可降低溶液pH，目标物的质子更易产生正电荷，提高检测灵敏度，优化峰型，增加响应值。流动相的等度方法虽然简单，但易使目标物和杂质同时被洗脱，所以选择梯度方法并保持有机相比例始终在较高水平，更利于目标物的分离。

3.5 质谱条件优化

阿维菌素和伊维菌素分子量均大于850，正离子模式下通常以加钠离子（Na+）、铵根离子（NH4+）方式结合，以分子量最大的伊维菌素为例，其Na+质谱参数详见表3。

表3 伊维菌素Na+质谱参数

[M+Na]+方式中2个离子的m/z均大于600，说明母离子结构稳定，难以裂解为碎片离子。比较阴性芥蓝样品的基质溶液配制标准曲线与流动相配制标准曲线的响应值可知，基质抑制作用明显，重复性较差，难以得到稳定的离子丰度比，存在一定的判定难度。因此，[M+Na]+方式并不理想。

[M+NH4]+方式虽然响应值略低，但基质曲线的峰型好，离子丰度比相对稳定，定性定量更加准确。向流动相中缓慢加入 0.5、1.0、1.5、2.0 mL 的 1 mmol乙酸铵溶液，观察峰型变化，试验结果表明，随着乙酸铵浓度的微量增加，峰型基本无变化，[M+NH4]+电离方式对乙酸铵溶液的浓度不敏感，[M+NH4]+方式比较理想、稳定。

为探讨离子传输毛细管温度对离子加合方式的影响，本试验测定了离子传输毛细管温度为270℃、310℃和350℃时伊维菌素的离子加合物 [M+Na]+和[M+NH4]+的响应值，详见图1。

图1 离子传输毛细管温度对离子加合物的方式的影响

如图1所示，[M+NH4]+随离子传输毛细管温度的增加而减少，[M+Na]+随离子传输毛细管温度的增加而增加。当温度为350℃时，伊维菌素中95%以上的[M+NH4]+消失，几乎全部以[M+Na]+的方式存在，且响应值很高。当温度为270℃时，伊维菌素中离子加合物的主要存在方式为[M+NH4]+，占60%以上，响应值虽略低，但能够满足试验需求。所以，若离子加合物方式为[M+NH4]+，则设定离子传输毛细管的最佳温度为270℃。

3.6 基质效应

基质效应（ME）是指在对样品中的目标物进行测定时，非目标物在目标物的分析过程中产生了干扰和影响，在一定程度上导致试验数据的准确性下降。ME往往和基质种类、目标物的结构及浓度、试剂的纯度、前处理方法等有关。消除ME的方法包括优化前处理方法、调节色谱质谱条件、选择内标法定量、配制基质标准曲线等。本文分别配制了不同基质的相同浓度的基质标准曲线和溶剂标准曲线，利用ME的计算公式评价ME：

其中，Sm—基质标准曲线的斜率；Sn—溶剂标准曲线的斜率。结果显示，80%以上的ME评价结果是抑制作用，数值为-18%至-5%。但由于其绝对值低于20%，属于弱ME，所以，在不影响结果准确性的前提下，本文选择以溶剂标准曲线方法定量，简单方便。

3.7 回收率与精密度

选用阴性果汁、梨、橙、苹果、芥兰、白菜、紫苏、生菜、板栗、辣椒、牛肉、牛肝进行添加回收率和精密度试验。在样品中分别添加 2.0、4.0、8.0 μg/kg的阿维菌素和伊维菌素标准溶液，按上述步骤测定并记录数据，计算回收率和相对标准偏差（RSD），详见表4。

表4 12种食品中阿维菌素和伊维菌素的回收率和相对标准偏差(n=6)

续表4

3.8 线性范围及测定低限

当阿维菌素和伊维菌素浓度在1.25、2.50、5.0、10.0、20.0、30.0 ng/mL 时，绘制标准曲线，计算线性回归方程，线性相关系数r均大于0.99，方法检出限为2.0 μg/kg。浓度为30.0 ng/mL的阿维菌素和伊维菌素的标准溶液的定量离子谱图详见图2。

图2 添加浓度为30.0 ng/mL的阿维菌素和伊维菌素标准溶液的定量离子谱图

4 结论

本文测定了果汁、梨、橙、苹果、芥兰、白菜、紫苏、生菜、板栗、辣椒、牛肉、牛肝12种食品中阿维菌素和伊维菌素。同时，比较提取溶剂的差别，阐述净化步骤的注意事项，优化色谱及质谱条件，分析ME，回收率、精密度、检出限均满足试验需求。本方法的前处理步骤简单、重复性好、准确度高、灵敏度高，适用于12种食品中阿维菌素和伊维菌素的检测。