大豆发芽过程中抗原蛋白降解及营养特性变化

安广杰 靳 颖 张培旗 胡金强 赵学伟 刘 洋 王章存

(郑州轻工业大学食品与生物工程学院，郑州 450001)

大豆是我国的重要经济作物，不仅是食用油的重要来源，也可为食品工业提供大量的蛋白质[1]。而且大豆蛋白质的氨基酸比例合理，与FAO/WHO 的推荐模式相近，有利于人体的消化与吸收。另外，大豆蛋白具有一定的乳化性、发泡性等，在食品加工中应用有利于改善食品的感官品质[2，3]。

然而，大豆又是国际公认的八大致敏食物之一。大豆蛋白在机体内可以引起一种由特异性IgE介导的，由细胞免疫和体液免疫共同作用的混合型的过敏反应[4]，其症状表现为腹泻、皮疹、荨麻疹，严重的伴有颤抖、咽喉水肿和急性哮喘等症状。目前，世界范围内13%的儿童和0.5%的成人都对大豆有不同程度的过敏症状，严重影响了大豆的食用价值。大豆蛋白的致敏性对人体生长发育的不良影响成为全世界广泛关注的公共卫生问题[5]。

大豆发芽是一种常见的加工方式，豆芽也是人们喜爱的传统优质食品。大豆发芽过程中发生一系列的代谢活动，产生多种生物活性物质，也有利于促进人体对大豆营养成分的消化与吸收，具有丰富的营养价值[6]。目前关于大豆发芽过程中营养成分的变化报道较多[7，8]。但涉及发芽中大豆抗原蛋白分子成分和抗原活性及其变化规律的报道极少。此次研究了不同发芽过程中的抗原蛋白的分子成分、主要抗原蛋白的抗原活性以及氨基酸、异黄酮、抗坏血酸等营养成分的变化，为开发低致敏性的大豆发芽产品提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

市售非转基因大豆、大豆β-伴球蛋白ELISA 试剂盒、大豆球蛋白ELISA试剂盒、低分子质量标准蛋白、考马斯亮蓝R-250、十二烷基硫酸钠、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、丙烯酰胺(Acr)，2,6-二氯靛酚、纯抗坏血酸、染料木素。

1.2 主要仪器

LRH-系列生化培养箱，FD-1-50型冷冻干燥机，JSM-7001F型场发射扫描电子显微镜，DYY-6C型电泳仪，835型氨基酸分析仪，iMark酶标仪，UV-8100 B紫外可见分光光度计。

1.3 方法

1.3.1 发芽大豆制备[9]

选取外观良好、籽粒饱满、大小均匀的大豆，将其分为七份，每份80粒，称重并记录数据。用蒸馏水冲洗数次后，将其浸泡于1.5%的次氯酸钠溶液中漂洗3次，浸泡在蒸馏水中12 h后，置于25 ℃生化培养箱中避光培养，每隔12 h浇一次水，每24 h取样一次，至第7 d结束。将取出的样品置于-20 ℃冷冻干燥、称重后保存。并分别与未发芽大豆干物质作对比计算干物质损失率(%)。

1.3.2 发芽不同时期大豆样品的结构形态变化

将冷冻干燥后的样品粉碎、过200目筛、分装贴标，对上述样品进行喷金镀膜处理，使用场发射扫描电子显微镜(FESEM)进行观察。

1.3.3 蛋白质分子质量的测定

将发芽和未发芽大豆的干燥物粉碎过200目筛，用Tris-Cl缓冲液(pH8.0)提取蛋白[10]。采用Laemml方法做SDS-PAGE电泳分析[11]。浓缩胶和分离胶浓度分别为5%和12%，考马斯亮蓝R-250染色，脱色后观察谱带变化。

1.3.4 大豆样品抗原活性的测定

称取不同样品粉末各50 mg，用Tris-Cl缓冲液(pH8.0)缓冲液提取蛋白。分别采用竞争法7Sβ-伴球蛋白和11S大豆球蛋白ELISA试剂盒检测抗原活性。具体操作步骤按照ELISA试剂盒说明书。用酶标仪在450 nm波长下测定吸光度(OD 值)，并通过标准曲线计算样品中抗原蛋白浓度。每个样品测定重复三次，以发芽样品测定结果与未发芽大豆结果的比值表示抗原活性剩余率/%，考查发芽过程中的抗原活性变化。数据采用ORIGIN 8.0软件处理。

1.3.5 氨基酸含量的测定

按照GB 5009.124—2016 食品安全国家标准食品中氨基酸的测定。主要步骤为：称取粉末样品各50 mg，用6 mol/L盐酸于110 ℃水解24 h，用氨基酸分析仪测定，色谱柱为磺酸型阳离子树脂，衍生剂为茚三酮，检测波长570 nm和440 nm。

1.3.6 抗坏血酸含量测定

以2,6-二氯酚靛酚滴定法测定[12]。用2%的草酸溶液提取，以0.1 mg/mL的纯抗坏血酸溶液作为标准溶液。每份样品重复3次。

2 结果与分析

2.1 大豆在发芽过程中干物质含量的变化

大豆种子萌发过程中将进行一系列新陈代谢活动。发芽前期，主要进行蛋白质、碳水化合物和脂肪的降解[13]。图1显示，大豆在发芽过程中干物质损失率不断增加，即干物质含量不断减少，至发芽7 d时干物质损失24.6%。尽管发芽过程不断有新的蛋白质和糖类物质的合成，但在避光培养时，由于不能进行光合作用，大豆干物质一致呈现减少的趋势。

图1 大豆在发芽过程中干物质含量变化

2.2 大豆在发芽过程中组织结构的变化

大豆吸水和发芽过程中，其组织结构发生较大变化。图2是利用场发射电子显微镜对样品表面超微形貌观察结果。可以看出，随着发芽时间的增加大豆子叶的孔径逐渐变大、结构变得越来越疏松。蛋白体逐渐融合形成大液泡, 原质体出现稀疏的片层结构。这与文献通过电镜观察的现象吻合[14]。文献中通过电镜观察到大豆随发芽时间的增加其子叶细胞内含物不断被消解；发芽第6天的大豆中有些蛋白体内只存有稀薄的絮状蛋白质，蛋白体膜清晰可见，甚至有的蛋白体基质已消失殆尽[14]。

图2 大豆在发芽过程中形态结构变化

这种结构有利于各种酶的活化和释放，进一步促进各种代谢活动，包括抗原蛋白的降解、豆芽生长需要的各种成分的合成等[15]。大豆中主要的蛋白是7S和11S储存蛋白，也是抗原活性较高的抗原蛋白。由此可以推断，大豆在发芽过程中抗原性可能会因为蛋白质的降解而降低。

2.3 大豆在发芽过程中蛋白质成分的变化

为了分析发芽过程中大豆蛋白的降解情况，本文将发芽不同时间样品做的SDS-PAGE，结果如图3所示，随着发芽时间的延长，大豆蛋白质的分子量呈现规律性变化，分子量较大的蛋白质逐渐减少，小分子蛋白逐渐增加。在发芽3 d时(泳道3)，大豆β-伴球蛋白的α′-和α-亚基颜色明显变弱，发芽5 d时，两个亚基几乎完全消失。相对而言，β-亚基降解较慢，发芽前3 d内谱带颜色几乎没有变化，发芽5 d时才明显变弱。可能是由于β亚基相较于α′和α亚基的结构更加稳定，不容易受到外界影响，因此不易发生降解[16，17]；在体外用商品蛋白酶制剂水解大豆蛋白时也出现了相似的规律[18]。

注：M：Marker；0:原始大豆；1:发芽1 d；2:发芽2 d；3:发芽3 d；4:发芽4 d；5:发芽5 d；6:发芽6 d 7:发芽7 d。

大豆11S球蛋白的酸性链在发芽到第4 d后迅速降解，发芽至5 d时，几乎看不到酸性肽链的存在，而碱性链在发芽6 d时谱带颜色仍然较深，降解不明显。这可能是与大豆球蛋白的晶体结构特点有关，酸性肽链比碱性肽链更容易发生水解，故酸性肽链消失的比较快[19]。

另外，大豆发芽3 d时，还产生了分子量范围大致为23～30 ku的4条新谱带，图中所示d、e、f 3个谱带颜色较深)，这些谱带是伴随着β-伴球蛋白的α′-和α-亚基的谱带减弱而出现的，推测它们可能是α′-和α-亚基降解后的产物。而且其后随着11S球蛋白酸性肽链谱带降解和发芽时间延长，这几条新生成的谱带颜色还有加深的趋势。有可能酸性肽链的降解后也形成了这些分子量相近的小肽。发芽过程中抗原蛋白分子的降解也意味中大豆抗原活性的降低。

Wilson等[20]曾报道了大豆发芽过程中和蛋白质亚基的变化，与本实验的电泳图谱有相似之处，但Wilson所用大豆实验材料中有比11S的碱性肽链更小的组分(14、17 ku)存在。可能与本研究的大豆品种有差异。

2.4 大豆发芽过程中的抗原活性变化

大豆发芽过程中，蛋白质分子发生不同程度的降解。为了探讨其抗原活性变化，本研究分别采用专用ELISA试剂盒分别测定不同发芽时间7S β-伴球蛋白和大豆11S球蛋白的抗原活性。

由图4a可知：随着发芽时间的增加，大豆中7S β-伴" />球蛋白和大豆11S球蛋白的抗原活性均出现降低现象，但二者变化幅度和趋势不同。在发芽的前4天中，β-伴球蛋白的活性剩余58%(即降低42%)，其后降低幅度较小，至发芽7 d时抗原性仍然达到52%。11S球蛋白的抗原活性变化较平稳，且变化幅度小于β-伴球蛋白，发芽7 d时抗原活性还有69%。

图4 大豆在发芽过程中其抗原性的变化

2.5 大豆在发芽过程中氨基酸含量变化

大豆具有很高的营养价值，其中一个原因就是由于其含有多种人体必需的氨基酸且组分合理，故对不同时期豆芽样品的氨基酸含量进行了测定与分析，以研究发芽处理对大豆的营养特性的影响，结果如表1所示。

由表1可知，大豆发芽过程中天冬氨酸的含量显著增加，谷氨酸的含量明显降低，其他氨基酸的含量没有明显变化，此结果与等研究发现的结果一致，说明大豆在发芽过程中天冬氨酸和谷氨酸参与的代谢活动旺盛[21，22]。

表1 大豆不同发芽阶段的氨基酸总量 / (%，干基计)

2.6 发芽大豆中抗坏血酸含量的变化

抗坏血酸即维生素C对人体健康具有重要作用。干燥的大豆种子中总抗坏血酸含量极少，而发芽会使抗坏血酸含量增加[23]。为探究度发芽时期抗坏血酸的变化规律，对发芽不同时期豆芽的抗坏血酸含量测定结果如图5所示。

图5 大豆发芽过程中抗坏血酸含量变化

由图5可以看出，发芽过程中大豆抗坏血酸含量呈现先增后降的趋势，在第3 d达到最大值，与文献中的结果相似[24]。据报道，发芽前期，大豆中半乳糖酸内酯脱氢酶活性较高，而此酶与抗坏血酸的合成密切相关[25]。但在发芽4 d后，参与合成抗坏血酸的酶基因表达水平降低[26]，从而导致抗坏血酸量减少。

3 结论

大豆发芽过程中，其组织结构形态、蛋白质分子成分、抗原活性和部分营养物质发生率规律性变化。子叶组织结构变得疏松，干物质含量逐步减少，大豆中的主要储藏蛋白7S β-伴球蛋白的α′和α亚基和11S球蛋白的酸性链降解较快，而β-伴球蛋白的β-亚基和11S球蛋白的碱性肽链降解较慢。β-伴球蛋白和11S球蛋白的抗原活性在发芽前4 d中降低较快，后期变化不同明显。氨基酸总量变化不大，但谷氨酸增加和天冬氨酸降低幅度较大。抗坏血酸含量先增加后降低。所以，在食用发芽大豆时仍然要注意食品安全性。