d-δ-生育酚抑制人晶状体上皮SRA细胞生长及相关机制

秦 程，曾新生，彭 勃，唐玉妮，周友弟，宋 博

0引言

白内障超声乳化吸除术联合人工晶状体植入术已成为治疗白内障的主要手段。然而，术后后囊膜混浊(posterior capsule opacification，PCO)仍是影响治疗效果的重要因素。术后PCO即后发性白内障是白内障手术后常见的并发症，是影响治疗效果的主要因素。PCO的形成主要是术后残留的晶状体上皮细胞过度增殖并移行于后囊膜，转化为成纤维细胞，产生胶原、分泌基底膜样物质而引起[1]。

天然维生素E(natural vitamin E)，学名生育酚(tocopherols)，生育酚同系物在自然界中广泛分布并且主要存在于各种植物中。d-δ-生育酚是其中的一种[2]。研究表明d-δ-生育酚在减少炎症、细胞增殖和肿瘤负担方面表现出了更大的能力[3]。我们通过实验探究d-δ-生育酚对人晶状体上皮SRA细胞生长的影响以及所涉及的相关分子机制，可能与凋亡相关蛋白bcl-2、bax或者与细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂CyclinD1、P21相关，以便发现其发挥作用的具体靶点，为d-δ-生育酚发挥其药物学功能，也为治疗及预防PCO提供理论支持。

1材料和方法

1.1材料实验用细胞株:人晶状体上皮SRA细胞(中国医学科学院肿瘤医院肿瘤研究所)、d-δ-生育酚(北京索莱宝科技有限公司)、RIPA裂解液、MTT试剂、二甲基亚砜，碘化丙啶，新生牛血清、1640培养基(Gibco公司)。主要仪器：分选型流式细胞仪(美国BD公司)、超高速冷冻离心机(德国Zeiss公司)、光栅型连续波长酶标仪、研究级倒置荧光显微镜、CO2培养箱、倒置相差显微镜(日本Olympus)、MLDEL酶标仪(美国Coulter公司)，P21、Cyclin D1、bax及bcl-2抗体均产自英国Abcam公司。

1.2方法通过预实验，MTT检测结果及IC50(半抑制率)值，筛选出5个实验浓度。将此次实验分为空白对照组(0μmol/L)及实验组，实验组设5个不同浓度的d-δ-生育酚(40、60、80、100、120μmol/L)，分别处理人晶状体上皮SRA细胞24、48、72h，使用20%胎牛血清的DMEM低糖培养液培养人晶状体上皮SRA细胞，在5.0% CO2饱和度、37℃恒温培养箱中培养。

1.2.1细胞形态学观察d-δ-生育酚处理人晶状体上皮SRA细胞24、48、72h后，显微镜下观察人晶状体上皮SRA细胞的增殖及细胞形态的变化，拍照记录结果。

1.2.2 MTT法检测细胞增殖取生长状态良好的SRA细胞，胰酶消化、离心、计数，使细胞密度为3.5×106/L，接种到96孔板，每个孔加入200μL，放于37.0℃、5.0% CO2恒温培养箱中培养，次日更换培养液，按所设药物浓度分别加入d-δ-生育酚，培养24、48、72h后，每孔加入20μL的MTT培养4h后终止培养，吸净旧液，每孔加入200μL DMSO(二甲基亚砜)，使用波长为490nm，酶标仪上检测OD值，以上实验重复3次，计算d-δ-生育酚对组胞增殖率的影响，细胞增殖抑制率(%)=(1-加药组OD值/对照组OD值)×100%。

1.2.3流式细胞仪分析细胞周期取对数期生长状态良好细胞接种于培养瓶中。往培养瓶中加入d-δ-生育酚，使其浓度分别为设定浓度，药物作用48h后用PBS洗两遍，用无EDTA的胰酶消化细胞，1000r/min, 5min，离心，加入5mL 75.0%预冷乙醇中，轻轻吹打均匀，-20℃固定保存。1000r/min, 5min，离心，PBS轻轻吹打细胞，洗两遍。0.5mL PBS重悬细胞，加入PI和RNaseA至终浓度50μg/mL，37.0℃温浴30min。上机检测细胞周期。

1.2.4 Western blot法检测d-δ-生育酚刺激人晶状体上皮SRA细胞P21、Cyclin D1、bax、bcl-2蛋白表达情况将人晶状体上皮SRA细胞传代后分6组。使其浓度分别为设定浓度，提取细胞蛋白，BCA法蛋白浓度定量，配制好15%的分离胶和5%的浓缩胶，每孔加入30μg为蛋白上样量，上样前沸水中煮沸5min使蛋白变性。准备电泳，先80V恒压，30min，等待浓缩胶跟分离胶分离之后，再调整电压至120V，50min。电泳结束后，恒定电流260mA，50min转膜，把转好的膜放入5%的脱脂奶粉封闭液中，摇床上室温封闭2h，封闭结束后，TBST洗3次，一次10min，放入提前配好的一抗孵育盒中(P21为1∶500；Cyclin D1为1∶500；bax为1∶1000；bcl-2为1∶1000)，4℃慢摇过夜，次日用TBST洗3次，一次10min，放入二抗孵育盒中，室温下慢摇1h，TBST洗3次，一次10min，发光。发光结束后得到目的条带，使用Gel-Pro Analyzer软件分析蛋白的相对表达量。

2结果

2.1倒置相差显微镜下观察d-δ-生育酚对SRA细胞形态的影响体外培养人晶状体SRA细胞呈多边形，胞体边界清楚，贴壁生长，胞质均匀，折光性强，生长速度快。d-δ-生育酚处理细胞48h后，倒置相差显微镜下观察，随着d-δ-生育酚的浓度逐渐增加，SRA细胞较对照组细胞明显减少，细胞密度逐渐变低，漂浮的死亡细胞逐渐增多，部分细胞皱缩变圆、贴壁不牢，见图1。

图1 倒置相差显微镜下观察48h后d-δ-生育酚对SRA细胞增殖的影响(100×) A：对照组；B：40μmol/L组；C：60μmol/L组；D：80μmol/L组；E：100μmol/L组；F：120μmol/L组。

2.2不同浓度d-δ-生育酚对人晶状体上皮SRA细胞增殖的影响MTT法结果显示，d-δ-生育酚分别作用于人晶状体上皮SRA细胞24、48、72h后，SRA细胞的增殖受到抑制，随着d-δ-生育酚浓度的逐渐增加，人晶状体上皮SRA细胞的增殖率也逐渐降低，随着d-δ-生育酚浓度的增高、作用时间的延长，SRA细胞增殖抑制率逐渐增高，且呈剂量-效应关系，这种关系范围在(40～120μmol/L)之间最为明显。分析结果显示，24、48、72h，六组抑制率差异均有统计学意义(P<0.001)，进一步做两两比较,三个时点结果都表现为对照组<40μmol/L组<60μmol/L组<80μmol/L组<100μmol/L组<120μmol/L组，两组间差异均有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 不同浓度组不同时间抑制率比较

2.3 d-δ-生育酚对人晶状体上皮SRA细胞周期的影响根据MTT的结果分析，人晶状体上皮SRA细使用d-δ-生育酚处理48h后，药物达到最有效抑制细胞增殖效果，故选取d-δ-生育酚处理细胞48h后作为实验对象。如图2示细胞被阻滞于S期，六组S期细胞率差异有统计学意义(F=69.447，P<0.001)，两两比较结果见表2。

图2 d-δ-生育酚对人晶状体上皮SRA细胞周期的影响 A：对照组；B：40μmol/L组；C：60μmol/L组；D：80μmol/L组；E：100μmol/L组；F：120μmol/L组。

表2 不同浓度组S期细胞率比较

2.4 Western blot检测Cyclin D1、P21、bax和bcl-2的表达d-δ-生育酚干预人晶状体上皮SRA细胞48h后，人晶状体上皮SRA细胞P21、Cyclin D1和bcl-2表达量逐渐降低，bax表达量逐渐增高，见图3。不同浓度组各蛋白表达水平比较，差异均有统计学意义(P<0.001)，各蛋白两两组间比较结果,见表3。

图3 Western blot检测Cyclin D1、P21、bax和bcl-2的表达。

表3 不同浓度组各蛋白表达水平比较

3讨论

正常的人晶状体上皮细胞为单层立方上皮,主要位于前囊下和赤道部，具有增殖和分化的能力,并且不断的产生晶状体纤维[4]。白内障摘除术术后,人晶状体上皮细胞失去单层性及晶状体皮质的压力，加速转化为成纤维细胞[5]，形成后发性白内障。据报道，多达20%～30%的患者术后会发生后发性白内障[6]，成人在2～5a内后发性白内障的发生率高达50%，儿童术后早期即可发生严重的PCO，儿童晶状体上皮细胞增殖能力强，因而PCO的发生概率高达100%[7]。目前治疗后发性白内障主要是激光后囊膜切开术，激光后囊膜切开术会伴有人工晶状体(intraocular lens，IOL)偏离、眼压升高、葡萄膜炎、黄斑水肿、甚至视网膜脱离等并发症[8-9]。除了手术治疗后发性白内障之外，目前临床上对后发性白内障的药物治疗及防治也有了大量的研究。许多药物已被证实可有效抑制人晶状体上皮细胞增生，如地塞米松、双氯芬酸钠、皂草素、姜黄素等。有研究表明，通过IOL而释放药物是药物作用的最佳途径，其原理是将抑制细胞增殖的药物以不同方式修饰于IOL表面或浸润、装载于IOL中，这种方式可以使白内障术后的药物逐渐释放从而抑制PCO的形成[10]。但是这些药物在起效的同时对眼内其他结构，包括对角膜内皮细胞、视网膜细胞等产生损害，可引起虹膜色素沉着、暂时性角膜水肿和黄斑水肿等并发症。这也是这些药物使用的限制性因素。而d-δ-生育酚在绿色植物中容易获得且安全，是一种天然药物，与其他药物相比有更好的优越性，并发症少。研究发现d-δ-生育酚在减少炎症、细胞增殖和肿瘤负担方面表现出了更大的能力[3]。而人晶状体上皮细胞的增殖与癌细胞的不断增殖有共性。因此推测d-δ-生育酚可能通过某些作用机制而抑制人晶状体上皮细胞的增殖。本研究发现，在显微镜下观察，对照组人晶状体上皮SRA细胞呈多边形，胞体边界清楚，胞质均匀，生长速度快。而实验组SRA细胞数量明显减少，细胞密度变低，漂浮的死亡细胞明显增多。随着d-δ-生育酚的浓度逐渐增加，细胞的增殖明显受抑制，具有剂量-效应关系。120μmol/L的d-δ-生育酚作用48h后，抑制率达(70.19±2.26)%。

细胞周期结果显示：d-δ-生育酚能明显抑制人晶状体上皮SRA细胞的增殖，并阻滞细胞周期于S期。Western blot检测结果分析，d-δ-生育酚抑制人晶状体上皮SRA细胞的增殖可能是通过抑制bcl-2、P21、Cyclin D1的表达，诱导bax的表达实现的。本研究结果对d-δ-生育酚用于后发性白内障的靶向治疗提供一种新的思路。

Western blot检测结果显示：与对照组相比，经d-δ-生育酚干预的人晶状体上皮SRA细胞随着药物浓度的增加，P21表达量逐渐降低，与预期的结果相反，分析其原因可能有:(1)有研究表明，P21在不同组织如在肾脏、鼻咽癌细胞株等组织或者恶性肿瘤中表现为表达下降，对其细胞的增殖呈负向调控作用[11-12]，而在心脏、食管鳞状细胞癌等组织中P21表现为高表达，对其细胞增殖的正向调控作用[13-14]。本研究在人晶状体上皮SRA细胞研究中获得低表达的结果提示P21在不同组织中的表达可能具有组织特异性，或者不同的药物的作用机制可能对P21产生不同的调控作用。这一结果提示在人晶状体上皮SRA细胞中，调控SRA细胞增殖的可能是CKI家族的其它成员，如Cyclin D1等。(2)P21蛋白为最早发现并克隆的CKI,可与多种CDK竞争结合Cyclin D1,从而抑制细胞的增殖,并且可与PCNA结合，阻断PCNA依赖的DNA复制，抑制CDK活性，从而使细胞生长受阻于G1期[15]。而细胞周期的结果显示d-δ-生育酚使细胞的生长阻滞在了S期，说明d-δ-生育酚诱导人晶状体上皮SRA细胞周期阻滞的途径与P21无关。(3)P21除了具有促进细胞凋亡的功能外，也具有抗凋亡的双重功能，本组人晶状体上皮SRA细胞中P21低表达，是否发挥了抗细胞凋亡的作用，其确切关系有待进一步探讨。

总之，本实验从几个方面初步探讨了d-δ-生育酚对人晶状体上皮SRA细胞的生长的影响，能够抑制人晶状体上皮SRA细胞的增殖。但是本实验还有许多不足之处，抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡的因子很多，这些因子是否发挥了凋亡的作用等，对于确切的机制我们还需要进一步的研究。d-δ-生育酚大量存在于绿色植物中，安全易获取，值得深入研究。因此，我们将进一步研究d-δ-生育酚在动物模型体内的应用前景，以更好地为临床PCO的防治提供理论与实验依据。