南北柴胡HPLC-ELSD指纹图谱的研究

2020-09-12 14:28:55 中国民族民间医药·下半月 2020年3期

郭泰麟 李丹丹 张慧

【摘 要】 目的:采用HPLC-ELSD法分别建立南、北柴胡的指纹图谱,并进行真伪鉴别。 方法:样品的甲醇提取液采用TOSOH TSKgel ODS-100V C18(4.6mm×15cm,5μm)色谱柱分析,乙腈-水梯度洗脱,流速:1.0 mL/min柱温:25 ℃,检测器为蒸发光散射检测器(ELSD)。并对结果进行相似度评价和主成分分析。 结果:建立了含有11个共有峰的北柴胡HPLC-ELSD指纹图谱和含有14个共有峰的南柴胡HPLC-ELSD指纹图谱。伪品的相似度低,可以通过指纹图谱进行真伪鉴别。 结论:该方法能快速可靠的鉴别和区分南、北柴胡,可以用于柴胡的质量控制。

【关键词】 柴胡;狭叶柴胡;HPLC-ELSD;指纹图谱

【中图分类号】R284.1 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517(2020)6-0019-06

Abstract:Objective AIM The fingerprints of Bupleurum chinense DC. and Bupleurum scorzonerifolium Willd. were established by HPLC-ELSD method, and to study their identification. METHODS The methanol extract of samples was performed on 25 ℃ themostatic TOSOH TSKgel ODS-100V C18 column(4.6mm×15cm,5μm) with mobile phase consisted of acetonitrile- water at the flow rate of 1 mL/min. The detector is ELSD. The results were analyzed by similarity and principal component analysis. RESULTS The HPLC-ELSD fingerprints of Bupleurum chinense DC. with 11 common peaks and the HPLC-ELSD fingerprints of Bupleurum scorzonerifolium Willd. with 14 common peaks were established. The counterfeits have low similarity, so it can be identified by HPLC-ELSD fingerprints. CONCLUSIONS This method can quickly and reliably identify and distinguish B. chinense DC. and B. scorzonerifolium Willd., and can be used for the quality control of Bupleuri Radix.

Key words:Bupleurum chinense DC.;Bupleurum scorzonerifolium Willd.; HPLC-ELSD;Fingerprints

柴胡为伞形科植物柴胡(Bupleurum chinense DC.)或狭叶柴胡(B.scorzonerifolium Willd.)的干燥根[1],习称北柴胡和南柴胡。原名茈胡,又名山菜、地薰、茹草等[2],始载于《神农本草经》,列为上品。具有疏散退热,疏肝解郁,升举阳气的功效。现代药理研究表明,柴胡具有解热、抗炎、保肝和免疫调节等作用[3-5]。柴胡作为临床常用药物,在解热和保肝方面用量大。但近年来由于北柴胡野生来源逐渐消失,南柴胡的野生资源基本绝种,市面上常见的南、北柴胡的来源均为人工种植。资源匮乏导致柴胡的价格逐渐上涨,市场内偶见使用伪品和正品掺在一起进行销售的现象。市场上常见的伪品有:苍蝇花的根[6]、陆地棉的根、野棉花的根[7]、寻骨风的根[8]。所以柴胡的质量研究逐渐成为热点问题。北柴胡的主产地在山西、陕西、辽宁等省;南柴胡的主产地在陕西、内蒙古、山西、甘肃等地。因此,药材质量的一致性问题也成为临床用药选购的重要依据。现有文献中对于柴胡指纹图谱的建立大多使用VWD或DAD检测器[9-11],使用ELSD检测器同时建立南、北柴胡指纹图谱的少见报道。基于此类问题,为保证柴胡质量一致性、解决用药混乱的问题,本实验对来自不同产地的24批北柴胡和5批南柴胡及其4种伪品通过HPLC-ELSD法分别建立指纹图谱,鉴定共有指纹峰,分别对不同产地的南北柴胡进行化学成分一致性的评价,旨在对柴胡药材的质量控制提供参考。

1 材料

1.1 仪器 Agilent1260高效液相色譜仪(Agilent Technologies, Santa Clara, California, USA);安捷伦G6240B蒸发光散射检测器(Agilent Technologies, Santa Clara, California, USA);KQ-250DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);LFP-800T高速多功能粉碎机;JD200-3千分之一天平(沈阳龙腾电子有限公司);Sartourius CP225D 十万分之一天平。

1.2 试剂 甲醇、乙醇为色谱纯(Merck KGaA, 62471 Darmstadt, Germancy),娃哈哈纯净水,对照品柴胡皂苷a(批号:P03M9F50593)购自上海源叶生物科技有限公司,柴胡皂苷d(批号:PS101397)、柴胡皂苷c(批号:PS000193)、柴胡皂苷f(批号:PS000195)均购自成都普斯生物科技股份有限公司。

1.3 药材 实验中所用到24批北柴胡(1-24)、5批南柴胡(25~29)和4批伪品(30~33)收集于全國各地的药材市场,由辽宁中医药大学张慧教授鉴定为伞形科植物柴胡(Bupleurum chinense DC.)及狭叶柴胡(B.scorzonerifolium Willd.)的根。具体样品信息见表1和表2。

2 方法

2.1 色谱条件 TOSOH TSKgel ODS-100V 色谱柱(4.6mm×150cm,5μm);乙腈(A)和水(B)为流动相进行梯度洗脱:0~15min: 20%~30% A, 15~20min: 30%~35% A,20~35min: 35%~40% A,35~70min: 40%~70% A,70~80min: 70%~75% A,80~85min: 75%~90% A, 85~90min: 90%~100% A。流速:1mL/min,柱温:25℃,进样量:20μL。蒸发器温度:30℃;雾化器温度:40℃;气体流速:1.6mL/min。

2.2 溶液的制备 取柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、柴胡皂苷c、柴胡皂苷f适量,精密称定,分别置于10mL棕色容量瓶中,用甲醇溶解并定容至容量瓶刻度线。制成柴胡皂苷a 0.401mg/mL、柴胡皂苷d 0.415 mg/mL、柴胡皂苷c 0.419 mg/mL、柴胡皂苷f 0.451 mg/mL的对照品溶液。

2.3 供试品的制备 取本品粉末(过65目筛)0.5 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,向内加入含10%浓氨试液的甲醇液25 mL,密塞,30 ℃水温超声处理(功率250 W,频率40 kHz)40min,滤过,使用甲醇20 mL分2次洗涤容器及药渣,洗液和滤液合并,在60 ℃回收溶剂至干。残渣加甲醇溶解,转移至5 mL容量瓶,使用甲醇定容至容量瓶刻度线,摇匀后过0.45μm滤,得供试品溶液。

2.4 方法学考察

2.4.1 稳定性实验 精密称取柴胡8号样品0.5 g,按“2.3”项下方法制成供试品溶液,按“2.1”项下方法分别于0、2、4、6、8、12 h间隔进样。以柴胡皂苷d的保留时间和峰面积为参照,计算相对保留时间和相对峰面积。结果显示,11个共有峰的保留时间和峰面积的RSD均小于1.03%和2.06%。表明本方法精密度良好。

2.4.2 精密度实验 精密称取柴胡8号样品0.5 g,按“2.3”项下方法制成供试品溶液,按“2.1”项下方法,连续测定6次。以柴胡皂苷d的保留时间和峰面积为参照,计算相对保留时间和相对峰面积。结果显示,11个共有峰的保留时间和峰面积的RSD均小于1.57%和2.22%,结果说明仪器精密度良好。

2.4.3 重复性实验 精密称取6份同样的柴胡8号样品各0.5 g,分别按“2.3”项下方法制成供试品溶液,按“2.1”项下方法,进样分析。以柴胡皂苷d的保留时间和峰面积为参照,计算相对保留时间和相对峰面积。结果显示,11个共有峰的保留时间和峰面积的RSD均小于2.15%和1.53%,说明该方法重复性良好。

3 结果

3.1 指纹图谱的建立 取24批北柴胡和5批南柴胡样品适量, 按“2.3”项下方法制成供试品溶液,按“2.1”项下方法进样测定,采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2012 版)分别对24批北柴胡和5批南柴胡样品进行指纹图谱的分析。以陕西宝鸡野生北柴胡(S4)为参照色谱,生成北柴胡的对照指纹图谱(图1);以山东临沂产南柴胡(S27)为参照,生成南柴胡的对照指纹图谱(图2)。结果在北柴胡的指纹图谱中共得到11个共有峰,南柴胡的指纹图谱上得到14个共有峰。共有峰面积均占指纹图谱峰面积的90%以上,北柴胡指纹图谱详见图3,南柴胡的指纹图谱详见图4。

3.2 指纹峰的鉴定 经查阅文献和与对照品图谱的比对,在南、北柴胡指纹图谱中定出5个成分的结构,分别是柴胡皂苷c(1号峰) ,柴胡皂苷f(2号峰),柴胡皂苷a(3号峰),柴胡皂苷e(4号峰),柴胡皂苷d(5号峰)。

3.3 真伪鉴别 通过将不同产地的南、北的对照指纹图谱及其伪品的指纹图谱(图5)相比较,二者之间具有显著性差异。其中苍蝇花根(S30)、棉花根(S31)和寻骨风根(S32)在色谱图前76分钟中几乎无色谱峰,而野棉花根(S33)的色谱峰跟其余三种伪品差别非常明显。并且四种伪品和正品柴胡的指纹相似度依次为:苍蝇花根(0.0710)、棉花根(0.257)、野棉花根(0.213)、寻骨风根(0.0801)。柴胡及其伪品的指纹图谱差异较大,所以根据HPLC-ELSD方法建立的南、北柴胡指纹图谱可以对柴胡的真伪进行鉴别。

3.4 柴胡指纹图谱相似度评价 采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2012 版)对24批北柴胡、5批南柴胡指纹图谱进行处理,以陕西宝鸡野生北柴胡(S4)为参照,计算11个共有峰的保留时间的相似度;以山东临沂产南柴胡(S27)为参照,计算14个共有峰的保留时间的相似度。结果表明,以柴胡皂苷d为参照峰,24批北柴胡、5批南柴胡各个共有峰保留时间RSD为2.51%和3.70%,差异性较小,北柴胡相似度在0.722~0.950之间,南柴胡相似度在0.767~0.927,表明不同产地的南北柴胡均具有一致性,不同产地的北柴胡相似度测定结果见表3,南柴胡相似度见表4。

3.5 主成分分析

3.5.1 北柴胡的主成分的分析 以北柴胡的HPLC-ELSD指纹图谱中的11个共有峰峰面积为变量,使用SPSS 24.0软件进行主成分分析。将特征值及贡献率作为依据,根据载荷量计算综合得分。北柴胡的主成分特征值及贡献率结果见表5。北柴胡中选出了3种主成分,因为这三种主成分对应的特征值大于1。3种主成分的累计贡献率达到了78.3%,说明了这3种主成分可以作为北柴胡质量的评价指标。其中主成分1中系数较大的是X2、X3、X4、X5;主成分2中系数较大的是X7、X9、X11;主成分3中系数较大的是X8;说明3个主成分中的8个共有峰对北柴胡质量评价贡献率较大,表明这8个共有峰对24批北柴胡的质量影响较大。

3.5.2 南柴胡的主成分分析 以南柴胡的HPLC-ELSD的指纹图谱中的14个共有峰峰面积为变量,根据载荷图计算综合得分。南柴胡的主成分特征值及贡献率结果见表6。南柴胡中选出4种主成分,4种主成份的累计贡献率达到了100%,说明了这4种主成分可以作为南柴胡质量的评价指标。其中主成分1中系数较大的是X1、X2、X5、X6、X7、X10;主成分2中系数较大的是X4;说明2个主成分中的7个共有峰对南柴胡质量评价贡献率较大,表明这7个共有峰对5批北柴胡的质量影响较大。

4 讨论

本文建立了24批北柴胡、5批南柴胡和4批伪品的HPLC-ELSD指纹图谱,北柴胡提取出11个共有峰,南柴胡提取出14个共有峰。利用中药指纹相似度评价软件南北柴胡进行相似度评价,结果显示,24批北柴胡相似度为0.722~0.950之间;5批南柴胡的相似度为0.767~0.927之间。表明了不同产地的柴胡具有成分的相似性。同时对柴胡的4种伪品进行了真伪鉴别,相似度分别为0.0710、0.257、0.213、0.0801。伪品和正品柴胡的相似度差异性大,这表明建立的指纹图谱可以对柴胡的伪品进行鉴别。

通过SPSS主成分分析的结果得出,影响北柴胡质量的差异性成分有8个,影响南柴胡质量差异性成分有7个。在伪品中并未检测到这些成分,说明通过SPSS得出的质量差异性成分同样可以对南北柴胡的真伪进行鉴别。并且通过对照品的指认和查阅文献,从这些差异性成分中鉴定出了5种成分,X1为柴胡皂苷c,X2为柴胡皂苷f,X3为柴胡皂苷a,X4为柴胡皂苷e,X5为柴胡皂苷d。在南北柴胡中这五种成分都存在。X2、X3、X4、X5这四种成分对北柴胡的质量影响较大,X1、X2、X4、X5这四种成分对南柴胡的质量影响较大。

综上所述,本研究建立的南、北柴胡HPLC-ELSD指紋图谱及主成分分析得出的影响南北柴胡的质量差异性成分,可以为柴胡的质量控制和真伪鉴别提供参考。

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(收稿日期:2019-12-04 编辑:刘斌)