甲基硬脂酸酯和E-β-罗勒烯对中华蜜蜂育王质量的影响

胡景华，赵方媛，张丽珍，江武军，廖春华，颜伟玉*

(1. 江西农业大学蜜蜂研究所，南昌 330045；2. 江西省养蜂研究所，南昌 330052)

中华蜜蜂Apisceranacerana(简称中蜂)擅于采集零星蜜源且抗胡蜂及抗蜂螨能力较强，是我国特有的当家蜂种，对我国养蜂业的发展以及生态系统的平衡均有着重要的作用(王静等，2013)。但由于西方蜜蜂的大量引入，中蜂存在竞争劣势使得生存资源骤减，种群的数量和分布区域均逐年下降(余林生，2007)。蜂王作为蜂群中唯一雌性生殖器官发育完全者，其专职任务就是产卵，因此蜂王品质优劣对蜂群的群势和生产性能等至关重要。优质的蜂王不仅有利于蜂群维持强群，且在产卵性能、抗逆性以及经济效益等方面均有重要意义(匡邦郁，2003)。因此，培育优质的蜂王可以显著提高蜂群的生产效益和竞争优势。

早期研究中单式移虫育王的发明实现了人工科学育王，后期的复式移虫则更进一步的提高了王台接受率和蜂王质量(Doolittle，1888；陈世壁，1989)。Le Conte研究发现，在培育西方蜜蜂蜂王过程中添加幼虫信息素成分甲基硬脂酸酯(MS)可提高王台接受率，添加甲基亚油酸酯(ML)可促进工蜂吐浆进而增加王台内王浆量，而甲基棕榈酸酯(MP)的使用则可提高王台中幼虫重量(Le Conteetal.，1995)。曾云峰等在蜂王培育过程中添加信息素，发现0.1% MP提高了中意蜂蜂王幼虫的重量(曾云峰等，2010)。邹垂彬等在中蜂育王过程中添加MP和ML，研究结果表明MP和ML并不能提高中蜂蜂王质量(邹垂彬等，2016)。

Gilley等在成年蜂王头部发现E-β-罗勒烯，未能成功介绍到无王群的蜂王E-β-罗勒烯含量在一周内一直处于相当低的水平(Gilleyetal.，2006)。另外在西方蜜蜂蜂群中添加E-β-罗勒烯可以显著提高蜂群对蜂王的接受率(Degrandi-Hoffmanetal.，2007)。在正常蜂群中由于存在蜂王信息素和幼虫信息素，可以抑制工蜂卵巢发育，从而防止工蜂产卵。Maisonnase等研究发现幼虫体表存在一种高挥发性物质E-β-罗勒烯，可以有效抑制工蜂卵巢的发育(Maisonnasseetal.，2009)。E-β-罗勒烯作为一种高挥发性信息素，很容易在整个蜂群中扩散，对各阶段工蜂的生理及行为均会产生影响。Maisonnasse等研究表明提高蜂群中E-β-罗勒烯浓度工蜂的采集日龄会提早，以增加食物储存量，为蜂群和幼虫提供更优质和充足的营养(Maisonnasseetal.，2010)。此外，E-β-罗勒烯还可以促进工蜂王浆腺的发育，从而影响蜂王浆的分泌(Traynoretal.，2014)，因此幼虫信息素E-β-罗勒烯与幼虫食物息息相关。后期大量研究证实，E-β-罗勒烯是蜜蜂幼虫的饥饿信息素，它与蜂群中食物信息相关，可以在调控哺育蜂发育的同时调控整个蜂群的采集行为(Maisonnasseetal.，2010；Traynoretal.，2014)。

为了进一步研究幼虫信息素成分甲基硬脂酸酯和E-β-罗勒烯对中蜂育王的影响，本研究通过在育王过程中添加甲基硬脂酸酯和E-β-罗勒烯，研究其对蜂王初生重、胸重、胸宽、单侧卵巢管数量以及Vg、hex70b和hex1103个基因表达量的影响，为培育优质中蜂蜂王提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 试验蜂群

试验所需蜂群为中蜂，均由江西农业大学蜜蜂研究所饲养。试验选取蜂群群势(5足框)、蜂群遗传性状和蜂王年龄都基本相似的3群蜂作为哺育蜂群。另取1群蜂王产卵性能良好的健康蜂群作为母本群用于产卵。育王在哺育群中进行，每群至少育王3次。试验期间，对蜂群进行奖励饲喂，提高工蜂哺育积极性。

1.2 免移虫育王

利用中华蜜蜂免移虫育王生产器(江西农业大学蜜蜂研究所研制)培育蜂王，免移虫育王的具体操作参照邹垂彬等(2016)的试验方法进行。同时，在幼虫60～64 h时，往王台中注入1 μL不同浓度(浓度梯度分别为0%、0.1%、1.0%、10.0%)的幼虫信息素酯类成分(Sigma试剂公司，纯度≥99%)与台内王浆液混合，每个浓度梯度设3个生物学重复，3个技术重复。在蜂王出房前1 d取出育王框，并将单个王台小心取下置于自制王笼中，并一同放置于恒温恒湿培养箱(BINDER)中进行孵化(35℃，RH 70%)，每隔1 h观察蜂王出房情况。

1.3 蜂王外部指标测定

培养箱中蜂王出房后立刻用电子天平测定蜂王初生重以及胸重；同时，采用CCD观察测试系统(江南永新光学有限公司)测量蜂王胸宽。测定胸重、胸宽的具体试验方法参照胡景华等(2018)的试验方法进行测定，记录数据。

1.4 蜂王卵巢管计数

解剖蜂王卵巢管时为了便于卵巢管的剥离，蜂王出房后饥饿预处理(饥饿2～4 h)，消耗掉体内脂肪。然后，参考许少玉等(1984)的试验方法对蜂王卵巢管进行解剖计数。

1.5 荧光定量PCR引物的设计及荧光定量PCR

蜂王出房后在超净台中解剖出蜂王卵巢，并参考秦秋红的试验方法对卵巢进行RNA提取以及反转录合成cDNA(秦秋红，2013)。荧光定量PCR试验中，Vg、hex110、hex70b基因以及内参基因(β-actin)的引物序列均沿用本人前期试验中设计的引物序列(胡景华等，2018)(上海生工合成，表1)。荧光定量PCR反应体系(10 μL)：1 μL样品cDNA，3.0 μL Nuclease-Free Water，上游引物和下游引物各0.4 μL，5 μL SYBR GREENⅡ以及0.2 μL ROX校正液。反应条件为95℃预变性30 s；95℃，10 s，58.9℃，1 min(40个PCR循环)；扩增反应结束后从55℃匀速加热(每6 s升高1℃)至95℃，建立熔解曲线。每个样品均设置3个重复。

表1 qRT-PCR引物序列Table 1 Primer sequences used in real time quantitative PCR

1.6 数据统计与分析

Vg、hex110和hex70b基因的表达量参考Livak等建立的2-ΔΔCt模型进行计算(Livak，2001)。利用StatView软件对试验数据进行统计分析，计算蜂王个体外部指标以及卵巢管数的均值和标准差。

2 结果与分析

2.1 甲基硬脂酸酯对中蜂蜂王质量的影响

2.1.1甲基硬脂酸酯对蜂王个体指标的影响

在育王过程中添加不同浓度的甲基硬脂酸酯进行处理，结果表明，0.1%、1.0%和10%浓度的试验组蜂王初生重和胸部指标均无显著差异(P>0.05)；但1.0%和10.0%的试验组，蜂王卵巢管数明显下降(P< 0.05)(表2)。

表2 甲基硬脂酸对蜂王个体指标的影响Table 2 Effects of MS on the index of queens

2.1.2甲基硬脂酸酯对蜂王卵巢Vg，hex70b和hex110表达量的影响

在育王过程中添加不同浓度的甲基硬脂酸酯对蜂王卵巢Vg、hex70b和hex110基因表达均无显著影响(P>0.05)(图1)。

图1 MS对蜂王卵巢Vg (A)、hex70b (B)和hex110 (C)表达量的影响Fig.1 Effect of MS on the expression level of Vg (A), hex70b (B) and hex110 (C) in queen’s ovary注：图中数据为平均数±标准差；柱上不同小写字母表示差异显著(t检验，P<0.05)。下同。Note: Data are mean±SD, and different lowercases above bars indicate significant difference (t-test, P<0.05). The same below.

2.2 E-β-罗勒烯对中蜂蜂王质量的影响

2.2.1E-β-罗勒烯对蜂王个体指标的影响

在育王过程中添加E-β-罗勒烯的结果表明，3个浓度处理组对中蜂蜂王的胸部指标均无显著差异(P>0.05)；但添加10%浓度的E-β-罗勒烯，蜂王初生重显著增加(P<0.05)；同时，1%和10%浓度E-β-罗勒烯处理可以显著增加蜂王单侧卵巢管数(P<0.05)(表3)。

表3 E-β-罗勒烯对蜂王个体指标的影响Table 3 Effects of E-beta-ocimene on the index of queens

2.2.2E-β-罗勒烯对蜂王卵巢Vg、hex70b和hex110表达量的影响

10.0%浓度的E-β-罗勒烯处理组，蜂王卵巢的Vg、hex70b和hex110基因表达量均显著增加(P<0.05)；在1.0%浓度处理组，只有Vg和hex110两个基因的表达量显著增加(P<0.05)；而0.1%浓度处理组，Vg、hex70b和hex110基因表达量与对照组比较均无显著差异(P>0.05)(图2)。

图2 E-β-罗勒烯对蜂王卵巢Vg (A)、hex70b (B)和hex110 (C)表达量的影响Fig.2 Effect of E-beta-ocimene on the expression level of Vg (A), hex70b (B) and hex110 (C) in queen’s ovary

3 讨论与结论

卵黄原蛋白基因(Vg)的高表达可以促进蜂王卵巢的发育，并延长蜂王寿命(Engels，1974；Amdametal.，2005；张卫星等，2014)。蜂王体内Vg表达量与保幼激素(JHIII)以及昆虫储存蛋白基因(hexamerin，hex)的表达相关(Coronaetal.，2007；Martinsetal.，2010)。JHIII又与蜜蜂的发育以及极型分化相关，而hex为昆虫从幼虫到蛹的变态发育提供物质基础和保障(Burmester & Scheller，1999；Barchuketal.，2007)。研究发现蜂王幼虫体内JHIII的含量与hex70b和hex110的表达量呈正相关(庞倩等，2017a；庞倩等，2017b)，而hex70b以及hex110的表达水平与昆虫的性别决定、寿命、免疫力以及繁殖力等生物学功能相关(Bitondi，2006；Martinsetal.，2008；Cristinoetal.，2010)。由此可推测Vg、hex70b和hex110基因的表达与蜂王体内JHIII水平相关并参与调控蜂王的卵巢发育，与蜂王的质量相关。

蜂王幼虫的良好发育离不开工蜂的积极哺育。早期研究发现甲基硬脂酸酯作为幼虫信息素之一，参与调节工蜂对幼虫的哺育行为，西方蜜蜂育王过程中添加甲基硬脂酸酯会促进工蜂积极哺育，提高蜡质王台接受率(Le Conteetal.，1995)。那么在中蜂育王过程中添加甲基硬脂酸酯是否也能促进工蜂积极哺育，使蜂王幼虫发育过程中得到更多的营养物质，从而提高中蜂蜂王的质量？本研究利用中华蜜蜂免移虫育王生产器，在育王过程中添加不同浓度的甲基硬脂酸酯，发现蜂王初生重、胸重和胸宽等个体指标均无显著差异，1%和10%浓度处理组的单侧卵巢管数显著减少，Vg、hex70b和hex110基因表达量也无显著差异。由此可见，甲基硬脂酸酯并未能显著提高中蜂蜂王质量，这或许是由于中蜂对甲基硬脂酸酯的反应与意蜂有所差异，相关机理还有待于进一步深入研究。

已有研究表明E-β-罗勒烯作为饥饿信息素的一种成分可以促进工蜂吐浆(何旭江等，2016)，而蜂王浆是蜂王及3日龄以内幼虫的主要食物，因此蜂群中E-β-罗勒烯浓度与蜂群食物或营养是否充足有关。本研究结果表明，中蜂育王过程中添加10%浓度E-β-罗勒烯可以显著增加了蜂王初生重和单侧卵巢管数，而且Vg、hex70b和hex110基因表达量也显著升高；添加1%浓度的E-β-罗勒烯可以显著增加蜂王单侧卵巢管数以及Vg、hex110两个基因的表达量。由此可见，添加一定浓度E-β-罗勒烯可以提高蜂王的生殖潜能，这可能是由于E-β-罗勒烯的添加促进了哺育蜂的积极性，对王台中的幼虫饲喂更为频繁，使幼虫得到更多新鲜的食物，从而培育出更优质的蜂王。在后续的研究中，可在育王过程中添加E-β-罗勒烯，进一步观察蜜蜂的哺育行为，并研究王台中王浆量的变化。

因此，在中蜂育王过程中添加E-β-罗勒烯可以在一定程度上提高蜂王的质量，但在实际生产中的经济效益(产浆量、产蜜量)、抗逆性、日产卵量以及维持蜂群群势的能力等均有待进一步研究。