野桑蚕Hippo通路核心基因的鉴定与序列比较分析

孟刚 彭云武 王瑞娴

摘要：Hippo信号通路在动物生长发育过程中起到关键作用。根据已知的Hippo通路组成基因序列，利用BLAST软件同源鉴定野桑蚕（Bombyx mandarina）转录组中的Hippo通路组成基因序列，利用生物信息学工具（ORFinder、web CD-search tool、Expasy-protparam、EMBL-EBI、MEME）分析蛋白质相对分子质量、等电点、二级结构、保守结构域和保守基序等。利用Clustalx和MEGA 6.0进行同源序列比对并构建系统进化树。在野桑蚕中鉴定了salvador、warts、mats、yorkie和scalloped同源基因，并预测了ORF框和编码蛋白。结果表明，野桑蚕Warts、Sav和Mats与家蚕同源蛋白的一致性均在98%以上，Yki和Scalloped与家蚕一致性分别为89.02%和79.13%。比较两者差异，家蚕Yki、Sd蛋白分别缺失了近WW2结构域和在YAP结合结构域中存在蛋白片段插入，野桑蚕Sd蛋白缺失了核定位信号基序和脯氨酸富集基序之间的铰链区。Yki和Sd可按照物种科属分别聚类，野桑蚕与家蚕聚为一支，表明这些同源蛋白在功能相似的同时，也具有基于物种的功能特异性。本研究为深入研究野桑蚕Hippo通路的作用机制提供理論基础。

关键词：野桑蚕（Bombyx mandarina）;Hippo通路;聚类分析

Abstract： The Hippo signaling pathway plays a key role in animal growth and development.According to the known sequences， we used BLAST software to identify the sequence of Hippo pathway component gene in the transcriptome of wild silkworm （Bombyx Mandarina）.  The protein molecular weight， isoelectric point， secondary structure， conserved domain and conserved element were also prospected and analyzed by ORFinder， web CD-search tool， Expasy-protparam， EMBL-EBI and MEME bioinformatics tools. The homologous sequence alignment and phylogeny were analyzed by Clustalx and MEGA 6.0 software. The homologous genes of salvador， warts， mats， yorkie and scalloped were identified in wild silkworm， and ORF frame and coding protein were predicted. The result showed that，Warts， Sav and Mats of wild silkworm shared up than 98% similarity with that of domestic silkworm， while Yki and Scalloped shared 89.02% and 79.13%  identity respectively between wild and domestic silkworm. The WW2 domain of BmYKi were deleted， and one peptide were inserted in YAP-binding domain of BmSd， while Sd of wild silkworm missing the hinge region between nuclear localization signal motif and proline-rich motif. Yki and Sd could be clustered into subgroup according to species， families and genera， wild and domestic silkworm were clustered into the same branch，suggesting that the homologous proteins could play species-based functional specificity as well as functional conservation. This study could provide a theoretical basis for further study on the mechanism of Hippo pathway in wild silkworm.

Key words： wild silkworm （Bombyx mandarina）; Hippo pathway; cluster analysis

野桑蚕（Bombyx mandarina）是家蚕（Bombyx mori）的祖先种，是培育家蚕优良种的重要素材资源[1-3]。生物器官尺寸调控是生命科学领域基于科学的问题之一，对经济动物而言，器官的尺寸是产量或质量的重要因素，如家蚕丝腺等。Hippo通路是一条存在于多细胞生物中且进化上高度保守的生长信号调控途径，是发育生物学及肿瘤生物学领域的前沿和热点话题，该通路不仅在调控器官尺寸大小方面起到关键作用，还参与干细胞自我更新[4]、组织再生、肿瘤发生和能量代谢[5，6]等生理生化过程。Hippo通路是一条在多细胞动物中普遍存在且高度保守的细胞信号转导途径，最早是在果蝇肿瘤抑制基因的遗传学筛选中被发现并逐步建立起来的。其核心部分是一个磷酸化级联反应途径，核心成员包括Ste20样蛋白激酶Hpo（Hippo）[7-9]、支架蛋白Sav（Salvador）[10]、NDR家族蛋白激酶Wts（Warts）[11]、肿瘤抑制蛋白Mats（Mob as tumor suppressor）[12]组成，而下游的转录激活因子Yki（Yorkie）[13]和介导Yki在特定DNA序列上结合的转录因子TEAD/TEF家族的Sd（Scalloped）将通路信号传递至细胞核内，实现基因转录调控[14-16]。

在家蚕中，20余个Hippo通路相关基因获得鉴定，部分基因获得克隆和功能研究[17-21]。Li等[22]鉴定了家蚕Hippo通路相关蛋白，分析了相关基因在家蚕各发育时期的表达模式，在家蚕细胞系中的上调、下调hpo和yki基因表达表明Hippo通路在家蚕发育及细胞周期调控过程中起到重要作用;Xu等[23]发现敲除家蚕Hippo基因可导致家蚕体形缩小，发育和躯体着色异常，且幼虫致死;齐海生[24]发现下调Bmhpo、Bmyki基因表达可导致家蚕前翅原基显著缩小;钱莹[25]在家蚕卵巢细胞中分别表达过Bmyki及其磷酸化位点突变体BmYkiS97A，细胞体积分别增大23%和27%，分裂期细胞数量分别增加14.7%和10.0%，而抑制Bmyki则使细胞体积缩小。野桑蚕中的Hippo通路尚无相关研究报道。

驯化使家蚕和野桑蚕在体形、器官尺寸和发育模式等许多方面均表现出显著差异。比较家蚕和野桑蚕的表型差异，发掘相关的分子机制，将为家蚕种质的遗传改良提供分子靶标和基因资源。鉴于Hippo通路在动物生长发育中的重要作用，本研究利用获得的野桑蚕全长转录本数据，在野桑蚕中鉴定Hippo通路关键基因，比较家蚕和野桑蚕之间的差异，探讨基因的亲缘关系，将有助于了解家蚕在驯化过程中种质变化的内在分子机制，为野桑蚕基因资源的发掘利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

用于鉴定野桑蚕Hippo通路关键基因数据来源于前期研究的转录组基因集数据（未发表）。

1.2 序列比对和基因鉴定

由于家蚕与野桑蚕的亲缘关系很近，利用家蚕Hippo通路相关蛋白序列作为查询（Query）序列，通过本地 BLASTP 和 TBLASTN 程序比对野桑蚕转录组数据集，获得野桑蚕Hippo通路关键基因的转录本序列。家蚕和其他物种的同源基因与编码蛋白序列均从GenBank（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/）数据库中获得。利用ORFinder（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）预测转录本的编码序列和氨基酸序列。所有序列均通过NCBI在线工具BLASTP予以核实。

1.3 结构域分析

利用Web CD-search tool（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/）預测编码蛋白的保守结构域。利用在线工具ExPASY（http：//wed.expasy.org/compute_pi）分析蛋白理化性质。

1.4 系统进化树构建

利用Clustalx软件进行核酸序列的同源性比对和相似性分析;采用MEGA6.0软件构建系统发生树，构建方法为邻接法（Neighbor-joining），参数设置为Bootstrap=1 000，Poisson model，gaps/missing处理方式为pairwise deletion。

2 结果与分析

2.1 野桑蚕Hippo通路关键基因的同源鉴定

通过序列比对和同源鉴定，在野桑蚕转录本中获得了salvador（sav）、warts（wts）、mats、yorkie（yki）和scalloped的核酸序列，并预测ORF框和编码蛋白。结果表明，野桑蚕sav开放阅读框长度为1 209 bp，编码402个氨基酸，与家蚕同源基因一致性为99.50%;warts开放阅读框长度为3 078 bp，编码     1 025个氨基酸，同家蚕同源基因一致性为100.00%;mats开放阅读框长度为654 bp，编码蛋白包括217个氨基酸残基，与家蚕同源基因一致性为98.84%;yki开放阅读框长度为1 314 bp，编码437个氨基酸，与家蚕同源基因一致性为89.02%;scalloped基因开发阅读框为1 239 bp，编码蛋白包含412个氨基酸残基，与家蚕同源基因一致性为79.13%（表1）。各蛋白的亲水性平均系数均小于0，表明均为亲水性蛋白。在野桑蚕转录本中未拼接得到hpo同源基因。

结构域预测分析表明，野桑蚕和家蚕Warts、Mats、Salvador蛋白结构域组成和排布均完全一致，其中野桑蚕Warts含有保守的STKc结构域、UBA结构域和Retinal超家族基序;SAV蛋白近C末端含有2个WW结构域;Mats蛋白含有Mob1 phocein结构域（图1）。两者在Yki和Scalloped蛋白序列上表现出显著差异。野桑蚕Yki蛋白存在2个WW结构域，而家蚕中仅存1个;野桑蚕Scalloped蛋白C端显著短于家蚕（图1）。

2.2 表达分析

利用转录组数据分析了野桑蚕Hippo通路相关基因在蛹滞育过程中的表达模式。结果如图2所示，warts和yki在蛹滞育各时期均处于高表达，sd、sav和mob表达水平相对较低，而hpo则接近无表达。

2.3 YAP和Scalloped的序列比较

YAP同源蛋白在不同物种间具有高度的保守性，人源YAP蛋白（XP_005271435.1）中的保守基序/结构域及其位点如图3所示，由N端至C端依次包括TEAD结合结构域（53～112）、14-3-3结合位点（122～133）、WW1结构域（174～204）、WW2结构域（233～261）、SH3结合位点（280～292）、C2结构域（307～359）和PDZ结合位点（506～510）等。以此为参考，不同物种的Yki同源蛋白中均鉴定得到与人源YAP蛋白中对应的等结构域或基序，其中TEAD结合结构域、14-3-3结合位点、WW1结构域和PDZ结合位点在不同物种间高度保守，而WW2结构域、SH3结合位点和C2结构域及各结构域之间的铰链区相似性相对较低，主要表现为相比于哺乳动物，昆虫同源蛋白在该区域存在不同程度的序列缺失。家蚕和野桑蚕的序列差异主要体现在家蚕Yki蛋白缺失了靠近C末端的WW2结构域（图3）。

人源TEAD1蛋白序列（UniProt P28347），其保守基序、结构域及位点如图3所示，由N端至C端依次包括TEA 结构域（30～87）、核定位信号位点（88～103）、脯氨酸富集基序（143～204）、YAP结合结构域（205～426）和丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸富集基序（306～328）。以此为参照，在不同物种的TEAD蛋白中均鉴定得到N端的TEA结构域和C端的YBD结构域以及核定位信号位点、脯氨酸富集基序、丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸富集基序等保守基序，这些结构域和基序在不同物种之间表现出高度的一致性，蛋白N端和结构域铰链区相似性相对较低，其中黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）、赤拟谷盗（Tribolium castaneum）和野桑蚕在核定位信号位点与脯氨酸富集基序的铰链区存在较大片段缺失。比较家蚕和野桑蚕可发现，野桑蚕Sd蛋白缺失了核定位信号基序和脯氨酸富集基序之间的铰链区，而家蚕Sd蛋白的YAP结合结构域中存在蛋白片段插入（图4）。

2.4 系统进化分析

在脊椎动物中，TAZ是YAP的同源蛋白。进化分析显示，脊椎动物和昆虫的YAP同源蛋白各自聚类。在脊椎动物中，TAZ和YAP又分别聚为亚群。在昆虫中，鳞翅目和膜翅目分别聚类，野桑蚕与家蚕的距离最为接近，双翅目昆虫表现出明显的多样性（图5）。

脊椎动物中共存在4种TEAD同源蛋白（TEF1、TEF3、TEF4和TEF5），而昆虫中仅存在一种，即Scalloped。聚类分析显示，脊椎动物中TEAD共同聚为1类，然后TEF1、TEF3、TEF4和TEF5等蛋白各自聚类为亚群;昆虫Scalloped蛋白聚为另1大类群，其下再以物种科属聚类成为亚群。在昆虫中，鳞翅目昆虫聚为1支，其中家蚕与野桑蚕距离最为接近，家蚕支显著长于野桑蚕，表明家蚕和野桑蚕亲缘性最为接近，同时该基因在家蚕进化过程中经历较多的选择过程（图6）。

3 小结与讨论

野桑蚕是家蚕的祖先种，比较野桑蚕和家蚕功能基因差异，有利于发掘野桑蚕基因资源，对于蚕桑产业发展具有重要意义。Hippo通路是一条由一系列蛋白激酶和转录因子组成的激酶链，与许多调控途径相结合，形成一个交互影响的调控网络，在个体生长发育过程中起到关键作用。在本研究中，根據同源比对，在野桑蚕中鉴定了Hippo通路salvador、warts、mats、yorkie和scalloped 5个核心元件编码序列，其中mats、sav和warts与家蚕同源基因的序列一致性在98%以上;野桑蚕yki和scalloped与家蚕同源序列的一致性分别为89.02%和79.13%。结构域分析表明，野桑蚕Mats、Sav和Warts和家蚕Hippo的结构域构成一致，而家蚕Yki蛋白缺失了靠近C末端的WW2结构域，家蚕Sd蛋白YAP结合域中存在蛋白片段插入，野桑蚕Sd蛋白缺失了核定位信号基序和脯氨酸富集基序之间的铰链区。结果显示，野桑蚕Hippo通路核心基因的功能及磷酸级联反应途径与其他昆虫相似，而该通路的末端作用因子Yki、Scalloped等功能及作用方式在家蚕和野桑蚕之间可能存在差异，由此是否影响对靶基因的调控，进而导致发育特征的显著差异，值得深入探讨。

在Yki和Sd同源蛋白的分子聚类上，脊椎动物和昆虫分别聚为两大类群，其下再按照物种科属分别聚类，暗示蛋白功能上的趋同，同时也有物种的特异化。尽管在序列上存在一定差异，野桑蚕仍然与家蚕聚为一支，暗示基因功能在两者之间存在相似性。本研究为深入开展野桑蚕Hippo通路与特殊种质性状的关联研究奠定了基础。

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