头腹针疗法对气虚质缺血性中风大鼠干预机制研究*

周海纯，韩晓庆，郭蕊珠，蔡国锋,4△

(1.黑龙江中医药大学附属第二医院哈南分院，黑龙江 哈尔滨 150001； 2.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040；3.哈尔滨市急救中心，黑龙江 哈尔滨 150001; 4.黑龙江省中医药科学院，黑龙江 哈尔滨 150036)

中风具有很高的致残率，严重影响了个人生活，并且在一定程度上阻碍社会经济的发展。近年来，大量学者对中风病深入研究，笔者查阅大量文献，经过系统研究，发现中风病9种体质治病原因，历经10余年对其进行大量研究，依据神经元再生理论，探讨中风后神经干细胞变化。大量文献及研究记载针刺治疗中风病效果显著[1]。依据中医理论，针刺可以刺激腧穴，疏通经络，提高人体调整能力，从而使人体最大限度的接近阴阳平衡的平和质状态，激发自身潜能，修复中风损伤。近年来已经取得了西医界广泛认同，研究证实针刺能够有效的调动内源性保护机制。

头腹针疗法作为针刺疗法的一种，由于痛苦小、操作简便、作用显著，近年来在临床普遍应用，在治疗中风临床方面已经有大量学者就其理论机制等进行了大量研究，具有较好的前期研究基础，验证了头腹针疗法的治疗效果，但查阅文献发现，其实验研究内容相对较少，同时对头腹针疗法治疗中风的研究很少依据中医理论采取辨证分型。本实验研究将头腹针疗法作为治疗方法，辨证分型将气虚质缺血性中风作为研究疾病，参考文献制备气虚质缺血性中风大鼠模型，从宏观神经功能及行为学功能变化、微观Hes1蛋白、基因变化对神经元再生的影响，探讨头腹针疗法治疗中风的作用机制，望为头腹针疗法临床治疗气虚质缺血性中风提供科学参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

健康雄性Wistar大鼠40只，体质量(300±20)g，由哈尔滨医科大学动物实验中心提供[动物实验许可证编号：SCXK(黑)2019-001]。

1.2 主要仪器和试剂

普通光学显微镜(Japan OLYMPUS company)；Bio-Rad核酸和蛋白电泳系统(美国 BIO-RAD伯乐公司)；电子婴儿秤(青岛艾讯电子衡器有限公司)；凝胶成像分析仪(无锡百泰克生物科技)；Bio-Rad核酸扩增PCR仪(广州杰特伟生物科技有限公司)；NanoDrop ND-1000浓度分析仪(Thermo,上海创萌生物科技有限公司)；恒温水浴锅(上海一科仪器有限公司);4℃低温离心机、上海电热恒温干燥箱(上海东麓仪器设备有限公司);抗体：兔抗人Hes1多克隆抗体(cam公司，#5702);β-Actin (13E5)Rbit m (CST公司，货号#4970)等。

1.3 模型制备及筛选方法

实验造模分为两个阶段，首先所有大鼠进行气虚质造模，成功后随机分为模型组、治疗组，每组15只模型大鼠，通过MCAO造模，选取合格模型予神经功能及行为学功能评分;另外10只为假手术组，不进行MCAO造模操作。

1.3.1 气虚质造模 第一步：饮食饮水量控制。鼠粮喂养方式以2 d无喂养与1 d正常喂养交替方式进行，8:30为供给鼠粮时间。饮食量控制参照公式:(供给鼠粮量-剩余鼠粮量)/实验大鼠数量；饮水量控制参照公式:(供给饮水量-剩余饮水量)/实验大鼠数量。

第二步：睡眠剥夺。隔日1次将大鼠置于跑台跑道内，以1 m/min跑台速度方式制造不稳定平面，每次持续时间24 h，对实验大鼠睡眠剥夺。每周对实验大鼠进行记录1次，记录内容为体质量、体温、摄食量、饮水量、抓力，其中对实验大鼠体温及抓力的记录取3次平均值，实验过程持续时间28 d[2]。

1.3.2 MCAO造模 气虚质中风大鼠模型成功后，予气虚质缺血性中风大鼠模型造模，手术方式依据目前公认的Zea Longa等建立的大脑中动脉阻塞术(MCAO) ，对气虚质中风大鼠实行大脑中动脉内栓线阻断法建造气虚质缺血性中风大鼠模型。

1.4 干预方法

1.4.1 模型组 术后不予任何治疗。

1.4.2 治疗组 采用针刺操作。取穴：头部采用头穴丛刺长留针法针刺，依据“大鼠穴位图谱”选择顶区及顶前区穴位[3]。腹针疗法引气归元腧穴取中脘、下脘、气海和关元。依据大鼠穴位的定位常用“比较解剖取穴法”“模拟骨度法”，在大鼠的腹中线上，以胸剑联合为定位点，以耻骨联合上缘为另一定位点，两者连线的上8/13与下5/13的交点定位为神阙穴;中脘:两者连线的上4/13与下9/13的交点; 下脘:两者连线的上6/13与下7/13的交点;关元:两者连线的上10/13与下3/13的交点;气海:神阙与关元中点处。

操作：在鼠板上固定气虚质缺血性中风模型大鼠，选取0．25 mm×15 mm华佗牌无菌针灸针，腹针在中脘、下脘、气海和关元穴位直刺2 mm，每日1次，每次留针30 min;头针刺入深度为沿皮平刺大约3 mm，每日1次，每次留针5 h[3]。

1.4.3 假手术组 对实验大鼠单纯动脉剥离即可。

1.5 脑组织取材

将模型组、治疗组气虚质缺血性中风模型剩余大鼠分成3批，分别于针刺3 d、7 d及14 d取材。使用EP管保留标本组织。使用储存设备选择-80℃超低温仪器。

1.6 评价方法

1.6.1 神经功能评定 造模成功24 h后，在疗前、疗后7 d及疗后14 d 3个时间节点对气虚质缺血性中风大鼠模型评分，并记录，评分依据为Bederson 4级评分标准[4]。

1.6.2 行为学功能测验 包括网屏测验(screentest)、平衡木测验(balancebeamtest)、抓握-牵引测验(prehensile-tractiontest)[5]。见表1。

表1 行为学功能评分标准

1.6.3 PCR检测 引物设计与常规 PCR扩增根据GenBank已发表的大鼠Hes1序列和β-Actin的序列，应用Premier5.0设计引物[6]。见表2。

表2 实验中所使用的引物序列

1.6.4 Western Blot检测 Western Blot[7]:第一步：蛋白的膜转移;第二步：筛选对应抗体;第三步：样品蛋白检测。操作：蛋白质膜上转移;检测：已知表达蛋白，抗体检测;检测：采用融合部分的抗体针对新基因的表达产物进行系统检测。

2 结果

2.1 各组神经功能评定比较

表3显示,模型组及治疗组均表现神经功能缺损，在治疗前模型组与治疗组神经功能缺损评分无统计学意义(P>0.05)，说明治疗前模型组与治疗组气虚质缺血性中风大鼠模型神经功能缺损程度差异无统计学意义;头腹针疗法治疗第7天、第14天后，治疗组神经功能评定明显改善，推断气虚质缺血性中风大鼠模型神经元的数量提高,同时模型组气虚质缺血性中风大鼠神经功能缺损在一定程度上也表现改善，分析原因气虚质缺血性中风大鼠脑组织自身具有较强的代偿修复能力;通过统计学结果可以看出，治疗组神经功能评定第7天、第14天与模型组比较差异均具有统计学意义(P<0.05)，说明头腹针疗法治疗气虚质缺血性中风大鼠模型第7天、第14天后，可以有效干预大鼠神经功能状态。21 d大鼠神经功能恢复，差异无统计学意义。

表3 各组神经功能评定比较

2.2 各组行为学检查比较

表4显示,在治疗前模型组与治疗组气虚质缺血性中风大鼠模型行为学功能缺损评分比较无统计学意义(P>0.05)，说明治疗前模型组与治疗组大鼠行为学功能缺损程度差异无统计学意义;头腹针疗法治疗第7天、第14天后，治疗组行为学明显改善，推断气虚质缺血性中风大鼠模型神经元的数量提高,同时模型组气虚质缺血性中风大鼠行为学功能缺损在一定程度上也表现改善，分析原因气虚质缺血性中风大鼠脑组织自身具有较强的代偿修复能力;通过统计学结果可以看出，治疗组气虚质缺血性中风大鼠模型行为学功能评定第7天、第14天与模型组比较均具有显著统计学意义(P<0.01)，说明头腹针疗法治疗气虚质缺血性中风大鼠模型第7天、第14天后，可以有效干预大鼠行为学功能状态。21 d大鼠行为学功能恢复差异无统计学意义。

表4 各组行为学比较

2.3 各组Hes1 mRNA比较

表5、表6和图1显示,神经元及神经胶质细胞中， 假手术组Hes1 mRNA在3 d、7 d和14 d无明显阳性表达，各时间点阳性表达无统计学意义(P>0.05);模型组Hes1 mRNA在3 d、7 d和14 d具有一定阳性表达，并且14 d阳性表达>7 d阳性表达>3 d阳性表达，说明气虚质缺血性中风大鼠在脑损伤后具有较强的自我修复能力；治疗组Hes1 mRNA阳性表达在3 d、7 d和14 d各时间点均表现明显，并且14 d阳性表达>7 d阳性表达>3 d阳性表达;治疗组Hes1 mRNA阳性表达与模型组比较，在第3天阳性表达差异无统计学意义(P>0.05)，说明头腹针疗法治疗对于气虚质缺血性中风大鼠的脑损伤后Hes1 mRNA表达在第3天可能不具有明显干预作用;第7天治疗组Hes1 mRNA阳性表达与模型组比较差异具有统计学意义(P<0.05)，说明头腹针疗法治疗对于气虚质缺血性中风大鼠脑损伤后Hes1 mRNA表达在连续治疗7 d后具有明显干预作用;第14天治疗组Hes1 mRNA阳性表达与模型组比较差异具有显著统计学意义(P<0.01)，说明头腹针疗法治疗对于气虚质缺血性中风大鼠脑损伤后Hes1 mRNA表达在连续治疗14 d具有极明显干预作用，同时连续治疗14 d干预作用优于连续治疗7 d。21 d大鼠痊愈，差异无统计学意义，说明大鼠具有很强的自身恢复能力。

表5 Hes1和β-Actin引物设计及验证

图1 PCR检测测定脑组织Hes1 mRNA表达

表6 PCR检测测定脑组织Hes1 mRNA表达比较

2.4 各组Hes1蛋白比较

表7、图2显示,神经元及神经胶质细胞中， 假手术组Hes1蛋白在3 d、7 d和14 d无明显阳性表达，各时间点阳性表达差异无统计学意义(P>0．05);模型组Hes1蛋白在3 d、7 d未见明显阳性表达，14 d可以观测到阳性表达，但很微弱；治疗组Hes1蛋白阳性表达在3 d、7 d各时间点均不明显，仅在14 d可见明显阳性表达;治疗组Hes1蛋白阳性表达与模型组比较，第3天、第7天差异无统计学意义(P>0.05),说明头腹针疗法治疗对于气虚质缺血性中风大鼠的脑损伤后Hes1蛋白表达在第3天、第7天两个时间点可能不具有明显干预作用，在第14天治疗组Hes1蛋白阳性表达与模型组比较差异具有统计学意义(P<0.05)，说明头腹针疗法治疗对于气虚质缺血性中风大鼠的脑损伤后Hes1蛋白表达在连续治疗14 d具有明显干预作用。21 d大鼠痊愈，差异无统计学意义，说明大鼠具有很强的自身恢复能力。

图2 脑组织Hes1蛋白表达

表7 脑组织Hes1蛋白表达比较

3 讨论

目前研究已经证实Notch信号通路的 “旁侧抑制” 作用对神经干细胞分化增殖具有干预作用[8]。Hes 是bHLH基因家族成员之一，是Notch信号的靶基因，在不同时期分别参与祖细胞的分属及干细胞的分化，其效应物 Hes1通过Notch信号通路抑制神经干细胞分化，促进神经干细胞增殖，因此本实验选择Hes1蛋白、基因作为观测指标，能有效的分析头腹针疗法治疗对于气虚质缺血性中风大鼠在脑损伤后的作用机制[9]。

头腹针疗法治疗中风历史悠久，近代临床研究明确，经络学中背为阳、腹为阴，腹部同时有阳经及阴经循行，有阴中之阴的任脉可以调阴，足阳明胃经和足少阳胆经两条阳经，因此还可以调阳[10]。有带脉束腰联络奇经八脉。人体十二经脉、奇经八脉紧密联系腹部与全身，同时在现代医学的不断深入研究下，脑肠肽理论逐渐得到众多医家的重视。脑肠肽是指既存在于胃肠道系统，又存在于脑中的肽类物质的统称，该发现进一步从生理角度证实了脑与胃肠道之间的联系。在发现脑肠肽之前，就有医家发现肠与脑之间存在着联系并提出了脑肠轴理论。经过研究发现脑肠肽对于脑肠轴的科学运行具有主导作用。脑肠轴的信息主要通过神经系统、内分泌系统、免疫系统和肠道菌群进行传递。脑肠轴在大脑和胃肠道之间是一个双向调节的通路，大脑的活动可以影响胃肠道，胃肠道的功能也可对大脑产生影响。

目前有研究表明胃肠道内的微生物菌群可以通过感染、免疫途径及内分泌系统参与调节人体的血压、血糖、血脂，同时肠道菌群代谢产物氧化三甲胺也会影响胆汁酸和胆固醇的代谢，并且能够使血小板大量聚集从而导致动脉硬化的产生[11]。而动脉硬化又是导致中风的主要原因。同时近年来有研究证实腹部是人类的第二大脑，即腹脑学说及脑肠肽理论。根据孙氏腹针疗法理论认为，腹部存在着一个完整的神经系统，其相当于人的第二大脑，腹部是大脑的全息影像[12]。针刺腹部能够促进或改善大脑的功能。此为头腹针疗法治疗主要理论基础。

本研究结果证实头腹针疗法治疗第7天、第14天两个时间节点，治疗组大鼠神经功能及行为学均得到明显改善，提示头腹针疗法治疗可以干预改善气虚质缺血性中风大鼠模型神经功能及行为学，从而推断头腹针疗法治疗可以促进气虚质缺血性中风大鼠模型神经元的数量增加。在第14天治疗组Hes1 mRNA阳性表达与模型组比较差异具有显著统计学意义(P<0.01)，治疗组Hes1蛋白阳性表达与模型组比较差异具有统计学意义(P<0.05)，说明头腹针疗法治疗可以干预气虚质缺血性中风大鼠脑损伤后Hes1 mRNA及Hes1蛋白表达，提示头腹针疗法治疗在一定程度上可以干预气虚质缺血性中风大鼠脑损伤后神经干细胞的增殖分化。