药用植物金花葵ISSR反应体系建立与优化

周伟 包晓华 何陈林

摘要    本试验以药用植物金花葵为研究材料，对金花葵ISSR反应体系进行优化。结果表明，最优体系为dNTP浓度为0.10 mmol/L、Taq酶浓度为0.25 U、引物浓度为0.20 mmol/L、Mg2+浓度为0.40 mmol/L、DNA浓度为50 ng;反应步骤为：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性45 s，55 ℃退火55 s，72 ℃延伸1 min，40次循环，72 ℃最后延伸10 min，4 ℃条件下保存。本试验建立的金花葵ISSR反应体系具有稳定性好、清晰度高、多态性丰富等优点，可为今后金花葵遗传多样性研究奠定试验基础。

关键词    金花葵;ISSR;体系优化

中图分类号    S567.21+9        文献标识码    A

文章编号   1007-5739（2020）17-0043-02                                                                                     开放科学（资源服务）标识码（OSID）

金花葵（Abelmoschus manihot（Linn.）Medic），又名金芙蓉、野芙蓉、菜芙蓉、黏干或山榆皮等，多年生锦葵科秋葵属植物，植株高大可达2 m，适应性特别强。2003年8月被中国农业科学院在河北邢台地区发现，属于濒危药用植物，目前在河南、河北、山西、吉林等地区人工种植，每年5月种植，7—9月为花期，果实成熟为10月。金花葵含有丰富的营养物质，包括黄酮、VE、氨基酸以及金丝桃苷等活性物质，具有较高的药用价值和保健作用。其叶片、鲜果以及茎杆含有丰富的氨基酸、微量元素和雌性激素，对于减轻或避免中老年更年期、延长女性青春期有突出效果。金花葵中黄酮的含量高达6%，比大豆的黄酮成分含量高出几十倍，具有镇痛、抗免疫、抗氧化、解热抗炎等多种药理活性。金花葵盛夏开花，具有无限开花结果习性，花大如盤，花径15～20 cm，可种植于庭院或花园供观赏，花中含有丰富的金丝桃苷成分，具有保肝、心脑血管保护以及抗炎作用[1]。历版《中国药典》以及卫计委部颁药品标准对于金花葵均未记载，鉴于金花葵有如上药用价值，应对其有效成分、生物活性进行深入研究，针对潜在价值深入挖掘。

ISSR是加拿大学者Zietkiewicz等人于1994年提出的，该技术是在一种简单重复序列基础上发展起来的新型分子标记，以锚定的微卫星DNA为引物，在SSR序列的3′端或5′端加锚2～4个随机核苷酸，在PCR反应中，锚定引物可以引起特定位点退火，导致与锚定引物互补的间隔不太大的重复序列间DNA片段进行PCR扩增[2]。本试验对金花葵ISSR反应体系进行了优化，以期为今后金花葵分子研究奠定基础。

1    材料与方法

1.1    试验材料

金花葵种子及其植株。

1.2    DNA的提取

利用无锡百泰克生物技术有限公司生产的PlantGen DNA Kit植物基因组DNA提取试剂盒对金花葵新鲜叶片进行提取。

1.3    基因组DNA的质量检测

取适当DNA原液将其稀释后，再量取5 μL DNA稀释溶液，然后再加入1 μL 6×Loading buffer（30 mmol/L EDTA，36%（体积比）甘油，0.05%（质量体积比）二甲苯氰，0.05%（质量体积比）溴酚蓝），搅拌混匀后，小心加入点样孔，以免胶被戳破，并且在第1个胶孔内点入6 μL DL 2000 DNA Marker作为分子量的标准，检测DNA浓度用1×TAE，1.5%琼脂糖凝胶电泳，电压调节至3 V/cm，胶板在凝胶成像仪上观察并拍照。

1.4    初始反应体系

本试验初始反应体系见表1。PCR扩增反应条件：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性45 s，55 ℃退火55 s，72 ℃延伸10 min，40个循环，72 ℃最后延伸10 min，4 ℃保存。以此为基础进行ISSR参数优化研究。

2    结果与分析

2.1    DNA纯度检测

金花葵叶片中含有大量营养物质，包括蛋白质、糖类以及维生素等，为DNA提取增加了难度，试验提取金花葵的DNA纯度高、亮度好、无降解，可完全满足后续试验的要求（图1）。

2.2    引物浓度

引物浓度大小对于扩增结果影响很大，若引物浓度过大可能会出现背景模糊不清或者重演性较差等不良现象。本次试验共设置了4个浓度梯度，分别为0.10、0.15、0.20、0.25 mmol/L。从图2可以看出，浓度为0.20 mmol/L时效果最优，条带多且清晰;浓度为0.10 mmol/L和0.15 mmol/L时扩增条带少，多态性差;0.25 mmol/L时无扩增条带出现。

2.3    Mg2+浓度

因为Taq DNA聚合酶对于Mg2+有较强的敏感度，并且还会有引物、扩增产物以及模板DNA等结合，扩增模板的数量也会受到Mg2+的影响。本次试验共设置了4个浓度梯度，分别为0.30、0.35、0.40、0.45 mmol/L。从图3可以看出，浓度为0.40 mmol/L时电泳效果最优，条带清晰均匀且多;浓度为0.35、0.45 mmol/L时条带较少，丰富性较差;浓度为0.30 mmol/L时条带不清晰，背景模糊。

2.4    dNTP用量

dNTP作为PCR反应的原料，其用量直接影响产物的产量、特性及合成的忠实性。本试验共设置4个浓度梯度，分别为0.08、0.10、0.12、0.14 mmol/L。从图4可以看出，浓度为0.10 mmol/L时，条带丰富性较好且较为清晰，效果最优;浓度0.08、0.12、0.14 mmol/L时条带不清晰，多态性较差。

2.5    DNA用量

DNA模板量也是影响扩增效果的主要因素之一。模板量过低，无扩增产物或产物少而不稳定;模板量过高，又会导致扩增条带的模糊和非特异性产物的出现。本试验设置4个浓度梯度，分别为50、60、70、80 ng。从图5可以看出，浓度在50 ng时，带数最多;在浓度60～80 ng时，出现带数少且模糊不清。因此，最优的浓度为50 ng。

2.6    Taq酶用量

Taq酶用量直接影响扩增反应成功与否，使用高浓度Taq酶易产生非特异扩增产物，但如果Taq酶浓度过低，则会导致产物合成效率下降。本试验共设置4个浓度梯度，分别为0.15、0.20、0.25、0.30 U。从图6可以看出，浓度为0.30 U时，条带清晰且均匀重演性好，为最优选择;浓度为0.25 U时，条带分布不均匀;当浓度为0.15 U、0.20 U时，条带较少。

3    结论与讨论

虽然 ISSR标记是一种随机标记，但是在一定条件下是相对比较稳定的，进行ISSR-PCR体系优化是十分有利的，因为得到适合该物种的反应程序和最佳体系，影响ISSR扩增的因素有很多，几乎组成反应程序和最佳体系中的每个因子都可以影响扩增的效果[3-4]。因此，要获得较清晰、稳定、可重复的条带，对于ISSR-PCR反应体系的各种影响因子（包括Taq酶、dNTP、Mg2+、引物浓度、模板浓度）进行试验是非常必要的。

在进行PCR扩增反应时，引物与模板结合后在Taq酶的作用下开始进行延伸，Mg2+对于Taq DNA聚合酶有依赖性作用，受Mg2+浓度的影响，而Mg2+与dNTP产生拮抗作用，各种因素浓度过高或过低，对扩增产物的质量都会产生影响，从而引起错配和非特异性产物的扩增，以至于增加引物二聚体的形成概率[5-6]。本研究最终建立金花葵ISSR最佳反应体系：在20 μL的反应体系中，dNTP浓度为0.10 mmol/L，Taq酶浓度为0.25 U，引物浓度为0.20 mmol/L，Mg2+浓度为0.40 mmol/L，DNA浓度为50 ng。PCR扩增反应条件：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性45 s，55 ℃退火55 s，72 ℃延伸1 min，40次循环，72 ℃最后延伸10 min，4 ℃条件下保存。通过对金花葵进行ISSR体系建立与优化，加深了对濒危植物金花葵的理解与研究，为今后利用分子标记技术对金花葵种质资源进行鉴定、分子标记辅助育种和遗传多样性研究等奠定了理论基础。

4    参考文献

[1] 唐晓清，王金羽，王宝华，等.金花葵引种及高产栽培试验[J].吉林农業，2018（15）：88.

[2] 杨诗婷，王晓倩，廖广辉.金丝桃苷的药理作用机制研究进展[J].中国现代应用药学，2018，35（6）：947-951.

[3] 卢丹，贾瑞波.中药金花葵的研究进展[J].中国药物评价，2015，32（2）：90-92.

[4] 张蕾，严萍，韩正洲，等.两面针ISSR-PCR反应体系的建立及优化[J].广州中医药大学学报，2012，29（1）：70-74.

[5] 孙叶，赵国琦，袁媛，等.96份中、日春兰资源遗传多样性的ISSR分析[J].分子植物育种，2020，18（5）：1535-1547.

[6] 蔡芷辰，刘训红，王程成，等.金银花分子生物学研究进展[J].中国中药杂志，2020，45（6）：1272-1278.