不同种源半夏的药用有效成分遗传变异研究

彭翠英， 梁军生， 蒲湘云， 袁 果， 王旭军

(1.湖南省林业科学院， 湖南 长沙 410004；2.湖南省林下特色生物资源培育与利用工程技术研究中心， 湖南 长沙 410004；3.常德市袁果中药材种植专业合作社， 湖南 安乡 415604)

半夏Pinelliaternata(Thunb.) Breit 为天南星科 Araceae 半夏属Pinellia多年生草本植物，喜温暖潮湿，耐荫蔽，广布于我国海拔2 500 m以下的草坡、荒地、田边或疏林下(内蒙古、新疆、青海和西藏等地除外)[1]。其干燥块茎即为著名传统大宗中药材半夏PinelliaeRhizoma，始载于《神农本草经》，列为下品，具燥湿化痰、降逆止呕和消痞散结等功效[2-3]。现代药理学研究表明，半夏在抗肿瘤[4]、抗生育[5]、降血脂[6]和治疗冠心病[7]等方面的应用潜力也巨大。因此，半夏一直以来受到众多医药工作者的青睐，市场年需求量约5 500 t[8]。为满足市场需求，半夏野生资源被过度采挖，加之农田生态环境改变，部分地区半夏野生资源已濒临灭绝。目前栽培半夏的种球未经遗传选择，或自繁自育，导致半夏药材质量良莠不齐。因此，半夏种质资源收集、评价及良种选育等亟待开展。“药材好，药才好”。种质资源的优劣对中药材的质量有着决定性的意义。种质资源的多样性不仅是优质药材形成的基础，更对中药材的良种选育有着极其重要的意义。研究结果表明，不同种源半夏不仅在出苗、展叶、抽薹及倒苗期等生长节律方面存在着差异[9]，在单株产量以及鸟苷和总生物碱含量等经济性状方面也存在显著甚至极显著的差异[10]。但这种差异是由环境因素引起的，还是由遗传差异导致的，目前尚未见相应研究的报道。因此，本文以16个半夏野生种源为材料，研究其总有机酸、生物碱和鸟苷等药用有效成分含量在种源水平上的地理变异和遗传变异规律等，以期为半夏良种选育和标准化栽培提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为2018年8月采集于永定区、中方县等16个产地的野生半夏(具体见表1)，每个种源采集鲜半夏5 kg，经去皮、洗净和晒干处理后研成粉末，过60目筛，然后 于60 ℃恒温烘干至恒质量后用于药用有效成分含量测定。

1.2 研究方法

1.2.1 试验方法 半夏的总有机酸含量按电位滴定法测定[3]；生物碱含量按分光光度法测定[10]；鸟苷含量按反向高效液相色谱法(HPLC)测定[10]。各3次重复。

1.2.2 数据处理 数据首先用WPS 2019 处理，再用SPSS 22.0 统计软件进行方差分析、相关分析和聚类分析等。各遗传参数的计算和隶属函数法分析则分别参照文献[11]和[12]进行。

表1 半夏种源地理气候因子Tab.1 The geographical and climatic factors of Pinellia ternata of different provenance 序号种源地经度/°E纬度/°N海拔/m年均温/℃年降水量/mm无霜期/d1月均温/℃7月均温/℃≥10 ℃积温/℃1永定区110.50 29.0172616.8 1 497 2705.128.0 5 400 2中方县109.9527.44 22916.9 1 378 2975.327.9 5 470 3溆浦县110.74 28.07 26816.9 1 539 2864.428.3 5 277 4新化县111.34 27.65 30316.8 1 454 2815.128.8 5 300 5沅陵县110.51 28.46 30716.6 1 441 2724.727.8 5 231 6酉阳县108.77 28.84 71814.9 1 332 2723.824.5 5 467 7龙山县109.29 28.78 25215.8 1 308 2854.726.4 5 023 8咸丰县109.49 30.2749015.7 1 455 2823.029.3 5 091 9古丈县110.47 28.55 24716.0 1 476 2764.627.0 4 997 10黎平县109.14 26.23 56915.6 1 322 2884.525.0 4 757 11辰溪县110.2127.84 43017.4 1 389 2935.128.1 5 389 12桃江县111.89 28.61 10316.5 1 700 2634.428.6 5 272 13麻阳县109.62 27.71 21217.2 1 255 2845.323.6 5 375 14吉首市109.70 28.25 20116.7 1 400 2855.426.5 5 177 15安化县111.72 28.24 40316.2 1 706 2474.328.0 5 263 16永顺县110.11 29.04 48616.4 1 357 2864.529.2 5 196

2 结果与分析

2.1 不同种源半夏的总有机酸含量比较

半夏的总有机酸具有止咳、祛痰及抑制体外肿瘤细胞的作用，为半夏药理作用的有效成分之一[13]。总有机酸含量越高，其止咳作用越强[14]。由表2可以看出：永定区种源半夏的总有机酸含量最低，为0.310%；所有种源半夏的总有机酸含量总均值为0.408%，全部种源半夏的总有机酸含量均高于《中国药典》的0.25%的标准，且所有种源半夏总有机酸含量的总变异系数仅为8.07%。这说明湖南省各地的半夏品质均优良，均可以作为药材供应市场，且种源间半夏的总有机酸含量变化幅度较小。但方差分析结果又表明，半夏的总有机酸含量在种源间的差异达极显著(见表2)。这又说明总有机酸含量在半夏种源间变异丰富，优良种源的选择潜力较大。

沅陵县种源半夏的总有机酸含量最高，达0.437%，且其变异系数仅为1.32%；其次为新化县、酉阳县、麻阳县等种源，其总有机酸含量均为0.433%，但其与沅陵县种源的差异未达到显著水平；总有机酸含量较低的为永顺县和永定区种源，其中永定区种源的总有机酸含量仅为沅陵县种源的70.94%，且其变异系数达到11.63%。这说明，相对其他种源，永定区的半夏的总有机酸含量相对较低，且变异幅度较大。

表2 不同种源半夏的药用有效成分含量比较Tab.2 Comparison of medicinal active ingredient content of Pinellia ternata among different provenances %种源总有机酸生物碱鸟苷均值CV均值CV均值CV永定区0.310 Bc11.630.010 3 Bcd47.410.076 2 ABab7.12中方县0.413 Aab7.780.018 9 Bbc21.150.033 9 EFg8.39溆浦县0.417 Aab2.770.032 5 Aa52.130.059 7 CDef6.73新化县0.433 Aab5.810.034 5 Aa4.270.059 0 CDef6.81沅陵县0.437 Aa1.320.010 2 Bcd5.270.070 0 ABCabcd6.71酉阳县0.433 Aab2.660.018 2 Bbc2.330.065 8 BCDcde2.00龙山县0.410 Aab6.450.013 8 Bbcd13.100.040 9 Eg13.31咸丰县0.403 Aab2.860.021 2 Bb13.850.069 8 ABCbcd2.68古丈县0.400 Aab0.000.017 3 Bbcd23.670.054 6 Df13.77黎平县0.407 Aab3.760.014 3 Bbcd5.300.025 2 Fh17.76辰溪县0.410 Aab4.220.013 2 Bbcd24.900.070 9 ABCabc17.90桃江县0.400 Aab2.500.013 8 Bbcd15.180.061 6 CDdef2.85麻阳县0.433 Aab4.800.008 8 Bd21.970.074 0 ABabc2.65吉首市0.417 Aab7.330.020 0 Bbc11.360.079 1 Aa4.37安化县0.410 Aab2.440.010 2 Bcd18.950.053 9 Df2.10永顺县0.397 Ab1.460.019 8 Bbc6.550.075 1 ABab1.13总均值0.4088.070.017 348.250.060 626.30F值6.669**6.582**30.914** 注:同一列中不同大、小写字母分别代表在0.01和0.05水平差异显著;**代表差异极显著(P<0.01)。

2.2 不同种源半夏的生物碱含量比较

生物碱为半夏药理活性的主要物质，具有止呕、镇咳、祛痰、降压、降脂等作用，以及抗肿瘤和增强记忆力之功效，其含量高低直接影响半夏药材的质量与疗效[15-16]。由表2看出，半夏的生物碱含量在种源间的差异也达到极显著水平，且其变异系数高达48.25%。半夏的生物碱含量在种源间的变异比总有机酸的大，因此，选育出生物碱含量高的半夏种源的可能性更大。

新化县和溆浦县种源半夏的生物碱含量较高，分别为0.345%和0.325%，且两者间没有显著性差异。溆浦县种源半夏生物碱含量的变异系数高达52.13%，远远高于新化县种源的(4.27%)。这说明新化县种源的生物碱含量高且稳定，而溆浦县种源的则变化幅度较大。其他种源生物碱含量与前两者的差异均达到极显著水平，特别是含量最低的麻阳县种源，其生物碱含量为0.0088%，约为新化县种源的1/4。

2.3 不同种源半夏的鸟苷含量比较

鸟苷也是半夏药理作用的主要有效成分，具有抗肿瘤、抗病毒、基因治疗等多种功效[17]。由表2看出：半夏的鸟苷含量在种源间差异极显著。其中，吉首市种源的鸟苷含量最高，为0.0791%，且其变异系数也仅为4.37%；其次为永定区、永顺县、麻阳县、辰溪县等种源的，但与吉首市种源的差异未达到显著水平。黎平县种源半夏的鸟苷含量最低，为0.0252%，仅为吉首市种源的31.86%，且其变异系数高达17.76%。

2.4 半夏药用有效成分含量的相关性

由表3看出，半夏的总有机酸含量与生物碱含量呈正相关，与鸟苷含量呈负相关，生物碱含量与鸟苷含量也呈负相关，但均未达到显著相关水平。这意味着半夏的总有机酸、生物碱和鸟苷含量所受控的基因组间连锁不密切，可以进行独立选择，也意味着选育出总有机酸、生物碱和鸟苷含量都高的半夏种源是很有可能的。

表3 半夏药用有效成分含量的相关性Tab.3 Correlation analysis of medicinal active ingredient content of Pinellia ternata成分 生物碱鸟苷总有机酸0.261 -0.035 生物碱-0.141

2.5 半夏药用有效成分含量与环境气候因子的相关性

由表4可以看出：半夏的总有机酸含量除与无霜期呈微弱正相关外，与经度、纬度以及海拔、年均温、1月均温等环境气候因子均呈微弱负相关。半夏的生物碱含量与经度、年均温、年降水量、无霜期、7月均温以及≥10 ℃积温均呈微弱正相关，与纬度、海拔、1月均温均呈微弱负相关。这意味着半夏的总有机酸和生物碱含量均可能与温度关系比较密切，温度越高，其总有机酸含量可能越低，而总生物碱含量却可能越高。半夏的鸟苷含量除与无霜期呈微弱负相关外，与经度、纬度等其他环境气候因子均呈正相关，特别是与纬度达到显著正相关水平。这说明半夏的鸟苷含量呈现比较明显的纬向变异，越靠北的种源，其鸟苷含量也可能越高。

表4 半夏药用有效成分含量与环境气候因子的相关性Tab.4 Correlation analysis of medicinal active ingredient content and geographical factors of Pinellia ternata成分经度纬度海拔年均温年降水量无霜期1月均温7月均温≥10 ℃积温总有机酸-0.134-0.281-0.441-0.084-0.2430.169-0.061-0.283-0.010生物碱0.125-0.006-0.1350.0290.0560.320-0.1270.3720.026鸟苷0.1190.565*0.1010.3210.070-0.1730.0130.1720.450 注:*代表在0.05水平上显著相关。

2.6 不同种源半夏的药用有效成分含量遗传变异

由表5可以看出，半夏的总有机酸、生物碱含量的遗传方差均小于其环境方差，而鸟苷的却刚好相反。这说明半夏的总有机酸和生物碱含量在种源水平上的变异程度受环境的影响比较大，而鸟苷含量的变异程度受环境的影响较小，能比较稳定地遗传。此外，半夏的总有机酸、生物碱和鸟苷含量在种源水平上的广义遗传力分别为0.2712、0.2743和0.6660(见表5)。这进一步说明半夏的总有机酸、生物碱含量在种源间的变异主要受环境影响，而鸟苷含量则受到中等强度以上的遗传控制，主要来源于种源自身的遗传特性。因此，以鸟苷含量为指标来进行半夏优良种源的选择是比较可靠的。

表5 不同种源半夏的药用有效成分含量遗传参数Tab.5 Genetic variation parameter of medicinal active ingredient content of Pinellia ternata of different provenances 成分遗传方差环境方差表型方差广义遗传力遗传变异系数/%环境变异系数/%总有机酸0.000 14 0.000 39 0.000 53 0.271 21 0.035 52 0.095 46 生物碱0.000 93 0.002 45 0.003 38 0.274 29 0.535 29 1.416 25 鸟苷0.000 05 0.000 02 0.000 07 0.666 03 0.079 25 0.039 74

遗传变异系数是衡量群体性状遗传变异潜力的重要参数。遗传变异系数越大，说明该群体性状的遗传潜力越大[18]。由表5看出，半夏的总有机酸、生物碱和鸟苷含量在种源水平上的遗传变异系数都比较小，这说明半夏优良种源选择的遗传潜力比较小，半夏良种选育可能更应重视种源内优良单株的选育。由表5还可以看出，半夏的总有机酸和生物碱含量的环境变异系数均大于其遗传变异系数，这说明栽培措施的改善可适度提高半夏的总有机酸和生物碱含量。

2.7 半夏不同种源聚类分析

广布种植物的地理变异模式有连续变异、区域板块变异以及随机变异等模式[19]。以总有机酸、生物碱和鸟苷含量为指标，采用平方Euclidean(欧式)距离，用离差平方和法进行系统聚类，建立聚类树状图(图1)。由图1可以看出，在遗传距离为5时，将16个半夏种源聚为4类：第1类为龙山县、黎平县、辰溪县、桃江县、沅陵县、麻阳县和安化县共7个种源，第2类为恩施县、永顺县、吉首市、中方县、古丈县和酉阳县共6个种源。第3类为永定区种源单独聚成1类，第4类为溆浦县和新化县种源2个种源。由以上聚类结果可以看出，既存在地理分布相近的种源如溆浦县和新化县种源聚为一类的现象，也存在地理分布相隔较远种源如龙山县、黎平县、桃江县和辰溪县等种源聚为一类的现象。这说明半夏种源存在随机变异、区域板块变异等地理变异模式。

2.8 半夏不同种源综合评价

半夏的药用有效成分种类多且复杂，主要含有机酸、生物碱、半夏蛋白、挥发油、氨基酸、淀粉等[20]，仅以总有机酸这一个指标远不能完全代表半夏的整体质量，更不能完全反映其临床疗效。因此，本文以总有机酸、生物碱和鸟苷含量为指标，运用隶属函数法综合评价不同半夏种源。综合隶属度值越大，说明该种源的品质综合评价越好。根据综合隶属度值的排名位次，筛选出新化县、溆浦县、吉首市、永顺县、酉阳县和咸丰县共6个表现较优的半夏种源。

表6 半夏的不同种源隶属度分析Tab.6 Analysis on membership function method of Pinellia ternata of different provenances 种源总有机酸生物碱鸟苷综合隶属度排序永定区0.000 0 0.058 4 0.946 2 1.004 6 15中方县0.811 0 0.393 0 0.161 4 1.365 4 13溆浦县0.842 5 0.922 2 0.640 1 2.404 8 2新化县0.968 5 1.000 0 0.627 1 2.595 6 1沅陵县1.000 0 0.054 5 0.831 2 1.885 6 7酉阳县0.968 5 0.365 8 0.753 2 2.087 5 4龙山县0.787 4 0.194 6 0.291 3 1.273 2 14咸丰县0.732 3 0.482 5 0.827 5 2.042 2 5古丈县0.708 7 0.330 7 0.545 5 1.584 9 10黎平县0.763 8 0.214 0 0.000 0 0.977 8 16辰溪县0.787 4 0.171 2 0.847 9 1.806 5 9桃江县0.708 7 0.194 6 0.675 3 1.578 5 11麻阳县0.968 5 0.000 0 0.905 4 1.873 9 8吉首市0.842 5 0.435 8 1.000 0 2.278 3 3安化县0.787 4 0.054 5 0.532 5 1.374 3 12永顺县0.685 0 0.428 0 0.925 8 2.038 8 6

3 结论与讨论

不同种源黄岑不仅在种子千粒质量、发芽率和发芽势等方面存在差异[21]，在黄芩苷和黄芩素等药用有效成分含量方面也具有显著或极显著差异[22]。蓝云龙的研究也表明，不同种源鱼腥草的甲基正壬酮、黄酮类成分含量及产量的差异均达显著[23]；何首乌二苯乙烯苷类、游离蒽醌类、结合蒽醌类等活性成分含量在鱼腥草种源间也存在显著差异[24]。药用植物生长量和药用有效成分含量在种源间存在着丰富的遗传变异，因此，开展药用植物种源选择能取得很好的遗传改良效果[25]。本研究结果表明，半夏的总有机酸、生物碱和鸟苷含量在种源间均存在着极显著差异，与王兵[26]、张君毅[10]、刘冬兰[17]等的研究结果类似。这些研究结果充分说明半夏的药用有效成分在种源间存在着丰富的遗传变异，其遗传改良和优良种源选择潜力巨大。但相关分析又表明，半夏的总有机酸、生物碱和鸟苷等药用有效成分含量在种源水平上两两之间的相关性均未达显著水平，说明半夏的总有机酸、生物碱和鸟苷等性状在种源水平上可能是独立遗传的，选育出总有机酸、生物碱和鸟苷含量都高的半夏种源是很有可能的。同时，半夏鸟苷含量的广义遗传力达0.6660，受到中等强度以上的遗传控制。因此，以鸟苷含量为指标来进行半夏优良种源的选择是比较可靠的。

药用植物的地理变异规律对于优质栽培产区筛选有重要指导意义[27]。广布种药用植物由于其栖息地气候条件和地势复杂，往往具备复杂的地理变异特征[19]。相关分析表明，半夏的鸟苷含量表现出比较明显的纬向变异模式，而总有机酸和生物碱含量则与经度、纬度均只呈微弱相关，地理空间变异模式不明显，与“鱼腥草挥发油类物质总量呈从西到东、从南到北逐渐增加的经、纬双向变异趋势”[23]相异。聚类分析表明，半夏种源间既存在地理分布相近的种源如溆浦县和新化县种源聚为一类的现象，也存在地理分布相隔较远种源如龙山县、黎平县、桃江县和辰溪县等种源聚为一类的现象。这说明半夏种源存在随机变异、区域板块变异等地理变异模式，与黄芩化学成分的地理变异趋势类似[22]。相关分析还表明，环境气候因子对半夏的总有机酸、生物碱和鸟苷含量的影响均不显著。因此，半夏药材质量的影响因素不能明确划定为“遗传型”或“环境型”，而应是遗传因子与环境因素共同作用的结果。因此，优质半夏的栽培应优先考虑环境，再选择种源。对栽培半夏进行品质育种时，可根据不同环境和种源分产地选择，以提高选育效果。

“药材好，药才好”。优质是药用植物良种选育的首要目标，主要表现在药用有效成分含量高低与稳定性。按照《中国药典》2015年版规定，半夏按干燥品计算，含总有机酸以琥珀酸(C4H6O4)计不得少于0.25%[3]。本研究结果表明，16个种源半夏的总有机酸含量变化范围为0.310%～0.437%，均远远大于《中国药典》的标准，且几乎所有种源(永定区除外)的半夏的总有机酸含量均高于目前半夏主产地之一的甘肃西和种源的[28]。这说明湖南产的半夏完全符合半夏药材生产的要求，在湖南各地发展半夏生产具有很大的潜力。但是，半夏的药用成分多而复杂，含有半夏蛋白、生物碱、多糖、亚油酸、琥珀酸类等多种有效成分，仅以总有机酸单个指标远不能完全代表半夏的整体质量，更不能完全反映其临床疗效。而隶属函数分析法能将不同指标放到同一个比较平台上定量评价，兼顾多个指标对品质的贡献，并已成功地应用于多种药用植物品质的综合评价。比如，张静等选取产量及可溶性糖、淀粉、纤维素、总黄酮、葛根素含量等为指标，运用隶属函数法从10份葛种质资源中筛选出4个适合广西推广应用的高产优质葛种质资源[29]。罗海玲等以块茎产量、可溶性蛋白、淀粉、蔗糖和还原糖等为指标，运用隶属函数法从31个山药种质资源中筛选出5个适合作为高产优质育种材料或鲜食新品种的优异亲本等[30]。本研究把总有机酸、生物碱和鸟苷等半夏主要药用有效成分含量等指标综合起来衡量半夏品质(质量标准)，针对性更强，更能准确反映半夏种源的药用品质。根据隶属函数值的排序，新化县、溆浦县、吉首市、永顺县等4个种源可作为湖南半夏发展的优良种源。永定区种源的半夏虽然总有机酸和生物碱含量相对较低，排序靠后，但其鸟苷含量高且稳定，可作为鸟苷提取的专用种源，或作为高鸟苷含量品种选育的亲本。