大菱鲆复合生物保鲜剂的优化及保鲜效果研究

方士元 梅 俊 谢 晶 励建荣

(1上海海洋大学食品学院，上海 201306；2上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心，上海 201306；3 上海冷链装备性能与节能评价专业技术服务平台，上海 201306；4食品科学与工程国家级实验教学示范中心(上海海洋大学)，上海 201306；5渤海大学食品科学与工程学院，辽宁 锦州 121013)

大菱鲆(Scophthalmus maximus)为鲽形目(Pleuronectoidei)鲆科(Bothidae)菱鲆属(Scophthalmus)高蛋白低脂肪的优质鱼类，是我国北方海水养殖的主要鱼种之一[1]。大菱鲆捕捞后易腐败变质，通常采用保鲜剂或气调包装结合冷藏或冻藏来减缓其变质进程[2]。

随着消费者对水产品安全问题日益重视，以及环保概念深入人心，使得研究人员对生物可降解保鲜剂的兴趣不断增加。复合生物保鲜剂由可食用和可再生资源制成，易降解，有助于减少环境污染，已得到广泛研究应用。然而，单一生物保鲜剂的保鲜效果有限，将多种不同功能的保鲜剂结合使用保鲜效果更好[3-4]。Nie 等[5]以茶多酚和海藻酸钠为复合保鲜剂对日本鲈鱼进行保鲜，发现此复合保鲜剂可显著降低鲈鱼脂质氧化和蛋白质分解水平。Thaker 等[6]研究添加壳聚糖、大蒜提取物和柠檬汁的鱼明胶涂布液对印度大马哈鱼鱼片品质和货架期的影响发现，大马哈鱼片货架期较对照组延长了6 d。而针对大菱鲆复合生物保鲜剂的研究相对较少。

乳酸链球菌素(Nisin)能显著抑制革兰氏阳性菌，乳酸钠对革兰氏阴性菌有抑制效果[7]，海藻酸钠作为食品涂膜基材时，有一定抗氧化作用，也是一些抑菌抗氧化物质的有效载体[8]。本研究选用Nisin、乳酸钠和海藻酸钠进行复合保鲜研究，以挥发性盐基氮(volatile base nitrogen，TVB-N) 为响应值，采用响应面Box-Behnken 设计优化保鲜剂最佳复配条件，并对复合保鲜剂的保鲜效果进行验证，旨在延长商品化包装大菱鲆整鱼的货架期，为大菱鲆生物保鲜剂的复配优化提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鲜活大菱鲆，上海市浦东新区芦潮港水产批发市场，充氧保活，30 min 内运到实验室；乳酸钠(色谱纯)、三氯乙酸(分析纯)、氧化镁(分析纯)、甲基红(分析纯)、溴甲酚绿(分析纯)、硫代巴比妥酸(分析纯)、无水乙醇(分析纯)、二甲苯(分析纯)、福尔马林(分析纯)，生工生物工程(上海)股份有限公司；平板计数琼脂(plate count agar，PCA)，杭州微生物试剂有限公司；Nisin(≥1 000 IU·mg-1)，阿拉丁生物试剂有限公司；海藻酸钠(分析纯)，国药集团化学试剂有限公司；总巯基试剂盒，南京建成生物工程研究所。

1.2 主要仪器与设备

BPS-100CB 恒温恒湿箱，上海一恒科学仪器有限公司；H-2050R 型台式高速低温离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；NMI20-060H-I 低场核磁共振成像分析仪，上海纽迈电子科技有限公司；Kjeltec 8400 凯氏定氮仪，瑞典FOSS 公司；WFZ UV-2100 型紫外可见分光光度计，尤尼柯(上海)仪器有限公司；LDZM-40KCS-Ⅲ立式压力蒸汽灭菌锅，上海申安医疗机械厂；Nikon-E200 光学显微镜，日本Nikon 公司；RM2235 冷冻切片机，德国Leica 公司；BIO-RAD iMark 酶标仪，伯乐生命医学产品(上海)有限公司。

1.3 响应面试验设计

鲜活大菱鲆冰水致死，去鳃和内脏，洗净沥干后去皮，切片(3 cm×1 cm×1 cm)，将3 种保鲜剂配制成不同浓度梯度的溶液，浸泡鱼体1 min，取出室温下沥干30 min，将其分装到无菌自封袋中于4℃冰箱保藏，定时取样测定TVB-N 值。根据前期单因素试验结果，确定Nisin、乳酸钠、海藻酸钠的最佳浓度分别为0.04%、6.00%和1.50%。

在单因素试验基础上，利用Box-Behnken 设计三因素三水平试验。将Nisin(A)、乳酸钠(B)、海藻酸钠(C)作为考察因素，以第9 天鱼样中TVB-N 值(通过预试验已确定贮藏期)作为响应值，通过响应面分析确定该复合生物保鲜剂的最佳配比，并与对照组(未添加保鲜剂)进行比较验证，试验因素水平设置见表1。为贴合实际采用整鱼进行复合保鲜浸渍处理。

表1 响应面因素水平表Table1 Factors and levels used in RSM design

1.4 指标测定

按照1.3 中的方法，使用响应面法优化的最佳配方处理大菱鲆，定时取样测定各项指标，并与对照组进行比较。

1.4.1 TVB-N 值测定 根据GB 5009.228-2016[9]，利用半微量定氮法测定大菱鲆的TVB-N 值，3 次平行。

1.4.2 菌落总数测定 参照GB 4789.2-2016[10]测定大菱鲆贮藏过程中的菌落总数。

1.4.3 pH 值测定 参照GB 5009.237-2016[11]测定大菱鲆贮藏过程中的pH 值。

1.4.4 巯基测定 根据巯基测定试剂盒进行测定，采用酶标仪测定412 nm 波长处的吸光度值。

1.4.5 持水力(water-holding capacity，WHC)测定参照王丽丽等[12]的方法。精确称取3 g 左右鱼肉样品(W1)，滤纸拭干样品表面水分后置于干燥离心管，4℃、3 000 r·min-1离心15 min，再精确称重(W2)，按照公式计算WHC:

1.4.6 光镜观察 参照李婷婷[13]的方法，将鱼块(5 mm×5 mm×5 mm)用5%福尔马林溶液固定24 h，经乙醇梯度脱水、二甲苯透明处理、石蜡包埋和切片染色后，在光学显微镜下(×100)观察切片组织。

1.4.7 低场核磁测定 参考Li 等[14]的方法。取鱼样(2 cm×2 cm×1 cm)用保鲜膜包裹，放入直径为70 mm 的核磁检测管中。使用CPMG 序列，设置T2测量参数。根据CPMG 指数衰减曲线图，用分析软件进行迭代反演得到横向弛豫时间T2图谱。用核磁共振成像仪对相同鱼样进行成像，得到质子密度图后对图像统一映射、伪彩分析。

1.5 数据处理

所有试验均重复3 次，利用SPSS 19.0 和Origin 9.0 软件进行统计学分析和绘制曲线，利用Design-Expert 8.0.6 绘制响应面曲面。

2 结果与分析

2.1 Box-Behnken 试验结果

根据前期单因素试验结果，Nisin、乳酸钠、海藻酸钠单独作用的最佳浓度分别为0.04%、6.00%和1.50%，在此浓度下既能保证大菱鲆贮藏过程中TVBN 值较低，又能减少保鲜剂的使用。由表2可知，响应面共设15 个试验点，中心试验重复3 次，以评估试验误差，所得中心试验误差较小，符合试验设计的要求。通过Design-Expert 8.0.6 对数据进行回归拟合，得到各保鲜剂与响应值(TVB-N)的二次多项式回归方程:

Y＝20.63 ＋3.08A- 2.74B＋1.54C- 2.19AB＋2.29AC-4.13BC＋3.31A2＋9.71B2-1.06C2

式中，Y为TVB-N 值；A、B、C分别为Nisin、乳酸钠和海藻酸钠的质量分数。

2.2 模型显著性检验及响应面分析

由表3可知，模型P值＜0.01，表明该模型极显著。模型失拟项P值＝0.185 4>0.05，不显著，模型选择合适，可以正确反映TVB-N 值与三因素之间的关系。相关系数R2＝0.997 1，模型拟合程度很好。变异系数(coefficient of variation，CV)越低模型的置信度越高，本试验的CV 值为2.29%，说明模型方程能反映真实试验值，可基于此模型对3 种保鲜剂的最佳配比进行预测。

表2 Box-Behnken 试验设计及其试验结果Table2 Box-Behnken experiments design matrix and results

表3 回归模型的方差分析Table3 Analysis of variance of regression model

由图1可知，等高线呈椭圆形，表示两因素交互作用显著，AB、AC、BC的P值＜0.01(表3)，说明2 种保鲜剂之间具有协同作用。当Nisin 和乳酸钠分别在低浓度范围时，海藻酸钠随浓度的增大抑菌效果逐渐降低，可能是因为高浓度的海藻酸钠包裹了Nisin 和乳酸钠，使其不能完全溶解分散，在鱼体表面分布不均[15]。此外，海藻酸钠浓度达到一定水平时，Nisin 和乳酸钠能与海藻酸钠交联形成网状结构，延长保鲜剂作用时间，提高拟菌效果。数据分析得到鱼肉TVB-N值最小时的保鲜剂配比为Nisin 0.04%、乳酸钠5.92%和海藻酸钠1.06%，该条件下的TVB-N 值为18.37 mg·100g-1。

2.3 复合保鲜剂对大菱鲆保鲜效果验证

2.3.1 TVB-N 值变化 由图2可知，贮藏8、10 d 保鲜组大菱鲆肌肉TVB-N 值显著低于对照组，贮藏12和14 d 时保鲜组TVB-N 值极显著低于对照组。说明复合保鲜剂具有良好的抑菌效果，可减缓细菌繁殖。

2.3.2 菌落总数变化 由图3可知，贮藏10 d 时保鲜组大菱鲆肌肉菌落总数显著低于对照组，贮藏0 d时，大菱鲆肌肉菌落总数为3.74 lg(CFU·g-1)，此时鱼肉处于新鲜状态[3]。贮藏10 d 后，对照组大菱鲆肌肉的菌落总数超过7 lg(CFU·g-1)，表明此时大菱鲆已经处于不可食用状态[16]，而保鲜组在贮藏12 d 时菌落总数超过7 lg(CFU·g-1)。对比标准，就菌落总数而言，保鲜组较对照组延长约2 d 货架期。说明复合生物保鲜剂可以显著抑制微生物的增长。

2.3.3 pH 值变化 由图4可知，对照组和保鲜组大菱鲆肌肉的pH 值变化趋势大体一致，这是由于贮藏初期糖原分解产生乳酸，导致pH 值下降，之后随着贮藏时间的延长，鱼体内蛋白不断分解为胺类等含氮物质，致使pH 值上升。贮藏第4 天，对照组和保鲜组的大菱鲆肌肉pH 值分别为5.41 和6.53，且保鲜组的pH 值极显著高于对照组。贮藏后期保鲜组大菱鲆肌肉pH 值上升幅度较小，总体变化平缓，说明复合生物保鲜剂可以延缓糖原的分解，从而抑制大菱鲆肌肉pH值的下降。由于乳酸钠和海藻酸钠水溶液为弱碱性，造成贮藏第14 天时大菱鲆肌肉pH 值偏高。

2.3.4 巯基含量变化 由图5可知，对照组和保鲜组大菱鲆肌肉的巯基含量均随贮藏时间的延长而降低，这与于林等[16]的研究结果类似。Ko 等[17]研究指出，肌原纤维降解会导致蛋白结构改变，暴露出的内部巯基被氧化成二硫键。保鲜组大菱鲆肌肉的巯基含量与对照组差异不显著，海藻酸钠和乳酸钠对巯基氧化抑制效果不佳，效果差于路钰希等[18]用乳酸钠、海藻糖处理的-20℃贮藏的鱿鱼。这可能是因为乳酸钠、海藻糖主要通过抑制冰晶的形成对鱼肉肌原纤维结构产生的破坏来抑制巯基变化，且高浓度的乳酸钠会增大蛋白质的疏水性，促进蛋白质变性。

图1 Nisin、乳酸钠和海藻酸钠交互影响TVB-N 值的曲面图Fig.1 Response surface plot of the effects of Nisin，sodium lactate and sodium alginate concentration on TVB-N

2.3.5 WHC 变化 WHC 反映鱼肉保持水分的能力，其对鱼肉的颜色、质地等食用品质具有较大影响[19]。由图6可知，冷藏初期大菱鲆肌肉的WHC 下降较快，随着贮藏时间的延长，保鲜组和对照组的WHC 均逐渐降低。大菱鲆冷藏过程中WHC 的下降可能是由于大分子网状结构被破坏[20]。保鲜组WHC 一直高于对照组，这可能是因为保鲜剂减缓了大菱鲆肌肉的自溶和劣变，从而较好地维持了其持水能力。

图2 大菱鲆在冷藏过程中TVB-N 值的变化Fig.2 Changes in TVB-N value of turbot during refrigeration storage

图3 大菱鲆在冷藏过程中菌落总数的变化Fig.3 Changes in total plate counts of turbot during refrigeration storage

2.3.6 肌肉组织变化 在低温贮藏条件下，对鱼肉组织结构损伤最大的影响因素是酶的作用和机械损伤[21]。由图7可知，对照组和保鲜组大菱鲆肌肉在贮藏第6 天细胞间隙略有增大，而在贮藏第10 天，两组的肌细胞均出现较大变形，肌肉组织结构破坏较为严重，在贮藏第14 天，对照组细胞间隙巨大，肌肉纤维扭曲变形、皱缩，间隙不均匀。然而，保鲜组肌肉结构略优于对照组，说明复合保鲜剂对蛋白的降解变性影响较小。

图4 大菱鲆在冷藏过程中pH 值的变化Fig.4 Changes in pH of turbot during refrigeration storage

图6 大菱鲆在冷藏过程中持水力的变化Fig.6 Changes in WHC of turbot during refrigeration storage

图7 大菱鲆在冷藏过程中肌肉组织微观结构的变化(×100)Fig.7 Changes in muscle microstructure of turbot during refrigeration storage(×100)

2.3.7 低场核磁变化 驰豫时间T2可以作为评估大菱鲆肌肉中水分分布及其迁移变化的重要指标。结合表4发现，弛豫时间T21指与蛋白质等羰基、氢键结合的水，这部分水波动较小，弛豫时间T23指自由水，变化趋势没有很强的规律性。而肌肉中的水主要以不易流动水(T22)的形式存在，和对照组相比，保鲜组驰豫时间下降更缓慢，而弛豫时间越短，表明水的流动性越差[22]，说明对照组大菱鲆的水分与肌肉结合的更紧密，而保鲜组的水分更易变成其他形式的水，但结合峰面积比例来看，对照组T21、T22和T233 种形式的水分子总和下降，说明胞内水转化为胞外自由流动水，保鲜组中不易流动水含量下降，结合水和自由水含量上升，这可能是由于海藻酸钠可以使表面水分子排列规整，形成稳定的结构。

图8为大菱鲆在贮藏第2、第8、第14 天的核磁共振成像图，用于分析保鲜剂对水分迁移的影响。贮藏第2 天大菱鲆肌肉内部的信号较强，主要呈现红色和亮黄色，此时肌肉中水分含量较高。随着贮藏时间的增加，肌肉水分降低，图像中表现为黄色部分增加，甚至出现蓝绿色。而在贮藏第14 天，对照组图像呈蓝绿色，而保鲜组仍然以红色和亮黄色居多，说明即使是贮藏末期，保鲜组大菱鲆肌肉内部仍有较高的水分含量。

3 讨论

Nisin 和乳酸钠具有较好抑菌能力，海藻酸钠是可食膜的常用基材。本研究根据单因素预试验结果确定Nisin、乳酸钠和海藻酸钠的最佳浓度分别为0.04%、6.00%和1.50%，在此基础上，利用Box-Behnken 法设计响应面优化试验。将Nisin、乳酸钠和海藻酸钠作为考察因素，确定该复合生物保鲜剂的最佳配比为0.04%Nisin、5.92%乳酸钠和1.06%海藻酸钠。

表4 大菱鲆在冷藏过程中驰豫时间(T2)及其振幅变化Table4 Changes inrelaxation time distributions (T2) and amplitudeduring refrigeration storage

表4 (续)

Nisin 是一种微生物源的生物保鲜剂，可以在细胞膜上产生细孔，通过结合类脂Ⅱ阻碍细胞壁的合成来显著抑制革兰氏阳性菌[23]。有研究人员使用Nisin 作为保鲜剂处理大菱鲆鱼片，可使大菱鲆鱼肉的货架期延长6～9 d[24]，但Nisin 抑菌谱较窄，主要对革兰氏阳性菌有抑制作用，而乳酸钠能抑制链球菌属(Streptococcus)、葡萄球菌(Staphylococcus)属生长，且与Nisin 有显著的交互效应和互补效应[25]。鱼肉内微生物的生长得到抑制，减缓了碱性产物的积累，有效地控制了pH 值的变化。Behnam 等[26]也观察到Nisin处理过的虹鳟鱼肉pH 值较对照组上升较慢。此外，乳酸钠与海藻酸钠溶液(弱碱性)具有一定缓冲作用，可缓解pH 值下降。

图8 大菱鲆在冷藏过程中核磁共振成像图的变化Fig.8 Changes in magnetic resonance imaging of turbot during refrigeration storage

肌肉中的结构蛋白决定了肌肉的WHC，蛋白质氧化会使WHC 下降。保鲜组和对照组大菱鲆在贮藏过程中WHC 不断下降，其中保鲜组下降更为缓慢，这可能是由于乳酸钠能降低鱼体的水分活度[15]，使水分与蛋白质结合更紧密，减缓鱼肉WHC 下降。海藻酸钠是具有保湿效果的亲水性多糖，能在鱼肉表面形成大分子网状结构[27-28]，也起到了减缓肌肉水分流失的作用。Khanal 等[29]研究也表明海藻酸钠有较高持水能力。

鱼肉贮藏后期，蛋白质氧化变性以及蛋白酶的降解作用，导致肌原纤维内部的汁液严重流失，肌肉出现明显缝隙[30]。而乳酸钠和海藻酸钠具有一定的抗氧化作用，保鲜组大菱鲆肌肉缝隙更小，这与WHC 的结论一致，此外，巯基是蛋白质中最易被氧化的基团之一，冷藏期间易被氧化成二硫键，而海藻酸钠能形成共轭烯烃酸结构[31]，与自由基电子结合形成稳定的自由基中间体结构，防止巯基氧化。但高浓度的乳酸钠会增大蛋白质疏水性，促进蛋白质变性，使内部巯基暴露易被氧化，或使蛋白聚集，导致检测到的巯基含量下降[32]。结果表明，适量的乳酸钠结合海藻酸钠对冷藏大菱鲆肌肉蛋白有保护作用，能延缓蛋白质的降解和变性。

4 结论

Box-Behnken 试验设计响应面法优化复合生物保鲜剂最优配比为Nisin 0.04%、乳酸钠5.92%、海藻酸钠1.06%。该复合生物保鲜剂可以有效抑制大菱鲆整鱼商品化包装中微生物的生长，减缓TVB-N 的产生速率，抑制pH 值的变化，提高鱼肉WHC，保持鱼肉的水分含量，减缓蛋白质结构的变化，对鱼肉脂类和蛋白质氧化也能起到一定的抑制作用。复合保鲜剂可将大菱鲆整鱼的货架期较常规4℃冷藏延长2～3 d。