生物功能化聚乙二醇基复合水凝胶的制备、性能研究及在感染创口修复中的初步应用*

冯杨英凡， 陈楷文， 王华楠， 陈 陶， 季 平△

1重庆医科大学附属口腔医院口腔颌面外科，重庆 401120 2大连理工大学生物医学工程学院，大连 116000

伤口愈合过程由止血、炎症、组织增殖和重塑4个阶段组成，各阶段相互交织且受到细胞、体液和分子信号等因素复杂而精细的调控[1]。皮肤屏障的破坏增加了病原微生物的侵入风险，由此导致创口的局部微环境发生变化。伤口愈合过程中自身的调控受到微生物干扰后，大量炎性细胞堆积，成纤维细胞代谢和血管重建受损，最终伤口迁延不愈形成疤痕组织[1-2]。有研究表明伤口感染在住院患者中的比例高达67.5%，这不仅严重降低了患者的生活质量，而且极大地消耗了医疗成本，造成了严重的社会经济负担[3]。目前针对感染伤口等复杂愈合环境，各种传统敷料如纱布、绷带等，多为干性结合易产生伤口粘连，且不易携带药物仅起到物理屏障的作用，因此促进愈合及防止感染的能力有限[4]。随着对伤口愈合研究的深入及技术的发展，各种新型的伤口修复材料不断更新并以加快伤口皮层细胞的修复过程并恢复组织功能为目的[5]，其中，水凝胶由于其独特的网络结构可作为新型感染伤口修复材料而受到研究者的广泛关注。

水凝胶是水溶性分子通过物理交联(氢键、主客体作用、离子键等)或动态化学键结合(亚胺键、二硫键等)所形成三维网络[6]。这种网络结构中富含水分子，其内部交错的孔隙通道有利于细胞物质交换及内部负载药物的扩散，使得水凝胶类材料在针对感染伤口，构建药用型伤口敷料上具有独特的优势[6-7]。此外，水凝胶具有良好的生物力学性能和可塑性，成胶前大多可流动及注射，适用于感染、溃疡等不规则慢性创口的覆盖[6，8]。但水凝胶在伤口愈合的临床转化上依然存在机械性能与生物相容性难以平衡；成本高昂、合成复杂不适宜批量生产；对不同愈合的复杂环境缺乏针对性等问题[5，9-10]。如何在易于生产的前提下，选择一种能可控地提升水凝胶的机械性能及生物相容性的水凝胶敷料，通过负载针对性药物来进行抗菌及抗感染治疗，对复杂病理环境下的伤口愈合具有重要的临床意义。

课题组前期成功构建了基于“缠结效应”的新型合成策略，通过将分散性聚合物链引入初级共价网络促进网络物理缠结，形成双网络水凝胶(DN)。该水凝胶选用简单而低毒性的聚乙二醇(PEG)作为模型，具有可调节的机械性能和理想的生物相容性，易于制备，可批量生产，具有临床运用的潜力[11]。但对于临床常见的感染伤口，该水凝胶未负载针对性药物，对细菌及炎症的控制能力有限；加之PEG本身缺乏粘附位点，不利于成纤维细胞、表皮细胞等长入[12-13]，在感染伤口等复杂病理环境下的促愈合能力有限。因此，本研究拟在DN水凝胶中增加甲基丙烯酸酐化明胶(GelMA)，进一步改善DN水凝胶的生物相容性，构建利于伤口愈合的微环境，同时加载抗菌药物庆大霉素以控制感染，促进复杂病理环境下伤口愈合过程，为后期水凝胶的临床应用及建立药用型水凝胶伤口敷料提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料

所有化学品均至少采用分析试剂级。PEG(分子量：6000，35000 D)、丙烯酰氯(99%)、乙醚、二氯甲烷、2-羟基-4-(2-羟基乙氧基)-2甲基丙哌酮(Irgacure 2959)和明胶A(取自猪皮，300 Bloom)购自Sigma-Aldrich公司。以丙烯酰三乙胺(99%)、碳酸钾(95%)、甲氧基酸酐为原料，采用加料法生产制备实验所需水凝胶。

1.2 聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)的制备

PEGDA的合成方式参照文献进行[11]。将不同分子量的PEG溶于100 mL二氯甲烷，获得澄清溶液后，在氮气条件下缓慢加入过量丙烯酰氯和三乙胺，置于冰浴条件下充分反应24 h。过滤沉淀并加入碳酸盐溶液以除去氯酸。收集滤液后加入乙醚结晶，真空干燥24 h以获得PEGDA。将所得PEGDA溶于去离子水，透析3 d纯化(透析袋分子量3 500 D)，所得终产物真空干燥24 h备用。

1.3 甲基丙烯酸酐化明胶(GelMA)的制备

称取10 g明胶加入100 mL磷酸盐缓冲液(pH=7.4)，60℃搅拌至完全溶解。取2 mL甲基丙烯酸酐单体缓慢加入缓冲液，连续搅拌1 h后，加入200 mL磷酸盐缓冲液猝灭反应。将所得产物置于37℃透析纯化3 d(透析袋分子量14000 D)，冷冻干燥24 h后，4℃保存备用。

1.4 合成DN-G复合水凝胶

称取400 mg PEGDA溶于1 mL去离子水，40℃下搅拌溶解以制备40%(W/V)PEGDA溶液，加入400 mg PEG溶液(分子量按前期筛选，采用35 000D以构建双网络体系)，制备DN水凝胶预聚液[11]。向DN水凝胶预聚液中添加GelMA进行初筛(1%、2%、5%，W/V)，40℃下充分混合溶解。最后，加入光引发剂I-2959使其质量分数为0.3%。将混合均匀的复合物预聚液放置在紫外灯(365 nm，100 mW/cm2)下光照1 min后成胶(DN-G-1或DN-G-2)。实验过程中充分混合5%GelMA的DN水凝胶成胶时间延长至3 min，为排除紫外光照时间对后续实验的影响，添加的GelMA浓度选用1%及2%。纯PEGDA水凝胶以相同步骤加入GelMA作为对照(PEG-G-1或PEG-G-2)。

1.5 水凝胶的微观形态

通过扫描电子显微镜SEM观察水凝胶形态及微观结构。将成胶后的水凝胶样本置于真空干燥机中冻干48 h。切成薄片后的冻干水凝胶喷金后扫描检测观察。利用Image J软件对水凝胶的孔径进行分析。

1.6 力学性能检测

通过压缩测试检测DN-G复合水凝胶的力学性能。按照1.4所述方法制备复合水凝胶预聚液并置于直径1 cm，高度为1 cm的圆柱型模具中，紫外灯(365 nm，100 mW/cm2)下光照1 min成胶(DN-G)。室温下，采用MTS-E43设备测试其压缩性能，加载速度为10 mm/min，每种凝胶测试4个平行样品，计算平均值和方差，并绘制应力-应变曲线。

1.7 复合水凝胶的生物相容性验证

通过以下2种方式检测水凝胶的细胞毒性：①将小鼠成纤维细胞L929于水凝胶上二维培养并进行CCK-8分析：将200 μL DN-G(或PEG-G)预聚液加入48孔板，按照1.4的方式成胶，加入基础培养液中浸没预处理DN-G(或PEG-G)水凝胶24 h。采用纯GelMA水凝胶作为阳性对照(浓度为5%)。将L929培养至对数生长期，胰酶消化后培养液中和并计数，在48孔板中以8000个/孔的密度接种。每2天更换培养液，动作轻柔以保证孔板底部水凝胶保持完整。在培养后不同时间点(1、4、7、10 d)进行CCK-8分析测定，并于450 nm下测量吸光度(A)值。细胞存活率(cell viability)通过如下公式进行计算：细胞存活率(%)=(A样本-A空白/A对照-A空白)× 100%，式中：A样本和A对照分别为样品组和对照组的吸光度，A空白为单纯基础培养液即空白组的吸光度。每组实验平行进行3次，取平均值。②将L929细胞置于水凝胶上进行二维培养并通过Live/Dead染色后置于荧光显微镜下观察。将水凝胶成胶后用直径为8 mm打孔器制作成圆形薄膜块，厚度均为1.5 mm，48孔板中紫外灭菌处理2 h后，置于基础培养液中37℃过夜预处理。将L929以1×104个/孔的密度接种。培养24 h进行Live/Dead染色，按照说明书中A液(Calcein AM)、B液(PI)均按1 μL/mL的浓度与Live/Dead染色工作液均匀混合，将种植了细胞的支架材料用PBS清洗3遍，随后用Live/Dead染液37℃避光孵育30 min，并于荧光显微镜下观察拍照，计数活细胞数目。每组随机选取3个视野，实验重复3次。

1.8 体外药物释放实验及抗菌实验

按照上述方式合成DN-G或PEG-G水凝胶后，使用10 mm打孔器打孔，制作大小均一，厚度为1 mm的水凝胶片。将水凝胶片置于5 mL 20 mg/mL的庆大霉素溶液中24 h以加载药物，滤纸吸干水分并真空干燥。将载药水凝胶片置于10 mL PBS(pH=7.2)缓冲液中，37℃温箱中以60 r/min进行释放实验。在预先设置的时间间隔内取出1 mL的释放液，并补充相同体积的新鲜释放液。释放液中庆大霉素的含量通过衍生物反应及紫外分光光度计进行测定[14]，以邻苯二醛为衍生剂，检测波长为332 nm。

实验采用金黄色葡萄球菌(ATCC 6538)检测载药水凝胶的抗菌性能，将含有或不含庆大霉素的DN-G(或PEG-G)水凝胶片置于2 mL金黄色葡萄球菌菌液中，菌液浓度采用梯度稀释法稀释至1×106CFU/mL，24 h后拍照记录并取适量测定吸光度值，检测波长600 nm，每组3个样本并计算平均值。

1.9 感染伤口模型建立

选择SPF级体质量约250 g的Sprague Dawley雄性大鼠，背部脱毛，1%戊巴比妥麻醉并消毒后，用打孔器制造10 mm×10 mm的圆形皮肤全层缺损创面。伤口涂浓度为2×108CFU/mL的金黄色葡萄球菌50 μL，利用枪头轻轻涂抹均匀，2 h后同样操作再次接种1次，观察伤口愈合情况。24 h后有淡黄色脓液渗出，创面边缘出现炎症反应证明造模成功。

选择12只SD雄性大鼠，按上述造模同法操作，在金黄色葡萄球菌伤口感染后，给予水凝胶敷料覆盖伤口。将大鼠随机分成3组，感染伤口未处理组(对照组)、DN-G组、DN-G+庆大霉素组(将庆大霉素溶于DN-G水凝胶预聚液中，药物浓度为2%，GS/DN-G组)；每组4只小鼠，每天拍照记录并观察伤口愈合情况，隔天给予伤口换药，以制造伤口时间为起点，21 d后处死取材，4%多聚甲醛固定后用于后续组织学评价。利用Image J软件计算小鼠伤口愈合面积并统计伤口愈合率。

1.10 组织学评价

以形成伤口时间为1 d，在21 d后按照重庆医科大学动物伦理标准处死实验动物，取伤口皮肤标本并放于4%多聚甲醛中固定24 h后，制作石蜡切片，常规苏木精-伊红(HE)染色，显微镜下观察伤口的组织学变化。

1.11 统计学方法

所有定量结果均使用Image J(v.1.8.0-172)进行数据统计并采用SPSS 20.0软件进行统计分析。两组间均数比较采用独立样本t检验，多组间均数比较采用单因素方差分析，以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 DN-G水凝胶的微观形态及力学性能

实验以初步探究GelMA在双网络水凝胶DN中的最低有效浓度为目的。在DN水凝胶中加入5%的GelMA时，成胶时间延长至3 min，考虑紫外光照时间会影响水凝胶的交联度及细胞毒性[13]，为保证实验的一致性及DN水凝胶的性质，实验中在DN中加入GelMA的浓度选用1%及2%进行(成胶时间与DN水凝胶一致)。DN-G水凝胶的扫描电镜观察如图1A所示。图中可见DN-G水凝胶样品均呈现出均匀的多孔结构，1%及2%GelMA的加入均可将水凝胶的孔径大小维持在16～24 μm(图1B)。

通过压缩实验评估GelMA改性的复合DN水凝胶(DN-G)的机械性能。如图2中所示，GelMA加入后DN水凝胶的压缩模量及压缩强度无明显改变，形变量50%时压缩强度在1500 Pa左右。

图1 DN-G复合水凝胶扫描电镜图(A)及通过Image J软件定量测量水凝胶孔径大小(B)Fig.1 Representative scanning microscopic images of the lyophilized hydrogels of DN-G(A)and Corresponding evaluation of the porosity of the hydrogels using Image J software(B)

图2 DN-G水凝胶的压缩应力-应变曲线Fig.2 Compression stress-strain curves of the DN-G hydrogel

2.2 DN-G水凝胶的细胞相容性

实验中常以细胞毒性作为材料生物应用毒性评估的前期基础，可检测水凝胶在体内实验和临床应用中的潜在危害。我们将小鼠成纤维细胞L929二维培养于DN-G及其相应组分的水凝胶上，通过CCK-8法测定成纤维细胞(L929)的存活率，评估材料的毒性大小。图3为L929细胞在水凝胶上培养不同时间后CCK-8所测得的细胞活性。可以看出，1 d后各组间细胞活性差异无统计学意义，PEG-G及DN-G的细胞相对生长率均大于90%，可见材料用于细胞培养时无明显细胞毒性。当培养时间延长至14 d时，PEG基水凝胶上的细胞增殖相对于阳性对照纯GelMA组有所减慢，但DN-G水凝胶的细胞增殖趋势好于PEG-G，其中DN-G-2的增殖好于其他PEG基水凝胶组及DN-G-1组，差异均具有统计学意义(均P<0.05)。

同时，为了更为直观地观察细胞存活状态及形态，通过Live/Dead染色观察二维培养于水凝胶上的L929细胞。图4是L929在不同水凝胶上培养24 h后的共聚焦显微镜成像。如图所见，细胞存活状态良好，无明显细胞死亡，在阳性对照纯GelMA水凝胶上细胞基本呈现梭型或多边形，PEG-G及DN-G水凝胶上均可见部分细胞聚集并多为球形，GelMA的加入对成纤维细胞的铺展有所改善，其中DN-G-2中细胞铺展呈梭型的情况较多。根据细胞增殖及铺展情况，后续实验中DN-G均采用2%GelMA进一步验证。

与DN-G-2组比较，*P<0.05图3 L929细胞在不同水凝胶表面随培养时间延长的增殖变化Fig.3 The proliferation of L929 cells cultured on the surface of the different gels as a function of culture time

2.3 DN-G水凝胶加载庆大霉素后的体外释放及抗菌实验

水凝胶本身的三维网络结构可作为药物缓释系统，在感染伤口释放药物抑制细菌增殖。实验采用水凝胶吸收硫酸庆大霉素并监测其对药物释放的影响，结果如图5A所示。在pH=7.4缓冲溶液中，3种水凝胶聚合物在前2 h时释放相对较快，均达到近30%，这主要来源于水凝胶表面负载药物的扩散；随后药物的释放呈缓慢上升趋势，DN-G水凝胶相对更为平稳，72 h的药物释放量为63%，药物释放性能良好。载药水凝胶的抑菌实验如图5B，与未负载药物的水凝胶对比，负载庆大霉素的DN-G水凝胶(GS/DN-G)72 h后培养液相对于其他组较为澄清，细菌生长受到抑制，具有良好的抗菌能力。

图4 L929细胞在不同水凝胶表面培养24 h时Live/Dead细胞染色情况(标尺=100 μm)Fig.4 Representative fluorescence microscopic images of Live/Dead staining for L929 cells cultured on different hydrogels for 24 h(Scale bar=100 μm)

图5 不同水凝胶负载庆大霉素的药物累计释放(A)及负载或不负载庆大霉素的不同水凝胶的抗菌活性及72 h细菌培养的宏观图片(B)Fig.5 Cumulative release of hydrogels loading gentamicin(A).Antimicrobial activity evaluation of various hydrogels loading gentamicin or not against S.aureus after 1 and 3 day(s) of culture；Representative photographs showing bacterial culture with different hydrogels after 3 days(B)

2.4 DN-G水凝胶加载庆大霉素用于感染伤口的治疗作用

选择SD大鼠构建的感染伤口模型评价复合水凝胶作为伤口敷料的治疗作用，实验分别设置DN-G组，GS/DN-G组和感染伤口未处理组(对照组)。由图6A可见，GS/DN-G组相对于其他两组伤口愈合速度较快，21 d后伤口基本痊愈。伤口愈合面积的统计分析结果显示(图6B)：DN-G组与对照组伤口愈合速率相似，差异无统计学意义；第4 天，伤口愈合在GS/DN-G组出现改善趋势(无统计学差异)，第7天后GS/DN-G组伤口愈合面积明显减小，差异具有统计学意义，第21天后感染伤口基本愈合。

图6 SD大鼠背部感染伤口愈合图片(A)及不同时间SD大鼠背部感染伤口愈合面积(B)Fig.6 Representative photographs showing the healing process of the skin wounds at different time points after treatments using the different treatments(A)and quantitative analysis of wound size of gradually healing wounds on day 21 after treatments(B)

2.5 组织学评价

通过HE染色对伤口进行组织学评价，如图7所示：对照组仍可见大量炎性细胞，肉芽组织形成较厚的瘢痕，几乎无上皮组织向伤口中心长入；DN-G组仍存在一定程度的炎性浸润，可见瘢痕组织；GS/DN-G组炎性细胞浸润聚集相对于前两组明显减轻，可见纤维细胞及血管等结构，上皮向伤口中心长入使得伤口间隙减小，疤痕增生不明显。

A：GS/DN-G组；B：DN-G组；C：对照组；下图为黑色方框的放大图图7 不同处理组小鼠伤口愈合21 d后组织HE染色Fig.7 Representative HE staining of the skin wounds after 21 days of treatment

3 讨论

伤口的愈合过程易受到一系列因素如年龄、全身基础性疾病、感染及异物等的影响，其中微生物定植带来的感染是如今导致伤口迁延不愈最为重要的因素[2]。细菌在伤口定居并繁殖，与应激产生的炎症细胞共同消耗大量氧气和营养物质，进而成纤维细胞代谢及增殖受损，导致伤口愈合的炎症期延长，增殖和重塑期推迟[15]。此外，机体免疫细胞吞噬细菌后释放蛋白酶和氧自由基，破坏胶原沉积形成大量疤痕组织[15-16]。对于慢性感染伤口，现有的伤口敷料总体治疗效果不佳且治疗费用较高，因此，开发能够早期抑菌、控制炎症、加快皮层细胞增生的针对性敷料一直是伤口愈合的研究重点及热点。近年来水凝胶类材料所构建的三维网络体系使其柔软且含水量高，与软组织及细胞外基质的性能匹配的同时可作为药物输送系统，因而受到研究者的广泛关注[7，17]。事实上，目前已有部分研究将水凝胶材料用于治疗感染伤口，以自身抗菌类水凝胶及负载抗菌剂的水凝胶最为常见，前者以壳聚糖及其衍生物为代表，通过聚合物分子自身实现广谱抗菌但其作用非常有限[18]；后者则形式多样，通过负载无机或有机抗菌剂抑制感染，构建利于促进愈合的微环境，但水凝胶的成胶时间、机械性能及药物释放等仍需进一步的精确控制[18-19]。

本课题组前期基于“网络缠结效应”，选用低毒性、低免疫原性PEG构建了机械性能可控的双网络水凝胶(DN)，但对于感染等复杂的病理性伤口愈合环境，DN水凝胶缺乏对细菌感染的有效控制，且PEG缺乏粘附位点不利于引导成纤维细胞等宿主细胞的生长[11-12]。因此，本实验在DN水凝胶中增加了GelMA以促进成纤维细胞的增殖及铺展，以改善愈合环境，促进伤口增殖及重塑的发生；同时，为减少细菌定植、控制早期炎症，实验在DN-G水凝胶内负载了庆大霉素，通过局部缓释作用达到早期抑菌，减少炎症细胞的产生，进而有效地促进了感染伤口的愈合。

事实上，水凝胶作为良好的细胞外基质类似物，具有适宜的机械性能，能够维持细胞所需微环境进而调节细胞的行为[20]，这也为研究者通过改善水凝胶的性能，构建感染等病理状态下伤口愈合所需微环境提供了新的思路。如Zhu等[21]在PPCN温敏性水凝胶上修饰了特征性短肽A5G81，增强整合素β3的作用以促进细胞迁移及增殖，从而改善了糖尿病慢性感染情况下的伤口愈合。现已有大量研究验证了细胞外基质的机械性能如刚度、应力松弛、粘附受体浓度等均可显著调节细胞的增殖、铺展及分化[22-24]。但众所周知，PEG作为人工合成类水凝胶缺乏粘附位点而对细胞的调控作用有限[12-13]，在感染等本就存在成纤维细胞功能受限的慢性伤口愈合的环境中，PEG基水凝胶的应用受到限制。考虑GelMA来源于天然细胞外基质，简单易得且保留了天然的细胞结合位点如RGD及基质金属蛋白酶解位点等[24]，本实验通过在双网络缠结水凝胶DN中加入GelMA，初步筛选改善成纤维细胞增殖及铺展的最小有效浓度，使水凝胶可进一步模拟细胞外基质的自然状态从而推动机体自身愈合进程。同时，DN-G水凝胶维持了DN双网络缠结水凝胶的孔径大小及机械性能，允许物质扩散及细胞长入，使得DN-G具有作为三维细胞支架的潜能，有利于后续进一步探究粘附位点的调控机制及作用。但值得注意的是直接物理共混高浓度的GelMA可能影响水凝胶的成胶效能(在DN水凝胶中加入5%GelMA使得成胶时间延长)，这可能是由于GelMA与PEGDA发生共价交联，影响次级物理缠结网络的构建有关，这提示后续研究可采用如接枝RGD短肽等方式提供粘附位点，保证缠结发生的同时精确调控细胞行为。

此外，水凝胶的三维网络及贯穿通道在运载药物及生物活性分子上具有得天独厚的优势。DN-G水凝胶负载庆大霉素后有效抑制了感染伤口的炎症，加速愈合，这可归功于水凝胶良好的载药能力，其局部缓释作用使药物持续维持一定浓度从而在早期抑制细菌增殖，避免大量炎性细胞堆积，改善了感染伤口愈合的环境，成纤维细胞得以进入伤口床触发后续愈合过程[25-26]。此外，使用水凝胶局部运载药物治疗感染伤口，可降低全身用药所带来的不良反应，在局部维持药物的治疗浓度，这对于局部感染性伤口的治疗具有重要意义[25]。现已有部分研究关注水凝胶自身材料的改性或对多种药物联合应用释放策略的调整，以使水凝胶得以适应感染伤口愈合的复杂环境[26-27]，但在水凝胶类材料作为感染伤口愈合敷料的临床转化上，仍然需要进一步建立精确的控制策略，实现对药物释放的靶向及时空控制，通过建立针对复杂环境的控释体系以应对感染等病态条件下的愈合延迟。

综上所述，本实验基于前期“缠结效应”合成的PEG基双网络水凝胶(DN)，通过GelMA生物功能化改性形成复合水凝胶DN-G，可维持稳定的网络结构及良好的机械性能，GelMA的加入为细胞提供了DN水凝胶缺乏的细胞粘附位点，可有效促进成纤维细胞在水凝胶网络中的增殖及铺展；另外，我们利用水凝胶良好的载药性能，将负载庆大霉素的复合水凝胶DN-G用于感染伤口，达到持续抗菌及促进愈合的作用，验证了DN-G水凝胶搭载药物用于病理状态下复杂环境伤口愈合的潜力。总之，DN-G水凝胶提供了一种成本低廉且操作简单的生物材料策略，可以作为一种新型的水凝胶敷料用于感染创面的保护及治疗。