杜鹃组培微枝试管外生根影响因素研究

王爱芝 王清君 刘运伟

摘要：  对杜鹃组培微枝试管外生根影响因素研究的结果表明，基质类型、基质处理方法、基质含水率、生长调节剂均对生根率有很大影响。在杜鹃无菌茎芽增壮培养基中添加0.8 μmol/L的2-ip培养7～8周，用300 mg/L的GGR速蘸茎芽基部，扦插在均匀拌入菌虫双杀0.84 g/L的纯草炭土中（pH值5.8，含水率75%），在室内组培驯化室进行试管外生根可得到较好的生根效果。

关键词：  杜鹃;  组织培养;  微枝;  试管外生根

中图分类号：   S 722. 3 + 7，  S 685. 21               文献标识码：   A                文章编号：1001 - 9499（2020）02 - 0010 - 04

杜鹃（Rhododendron）是杜鹃花科植物中种类最多的一个属，原产于北美洲、西欧和北亚，目前共发现1 000多种[ 1 ]。杜鹃的花期长，从冬末到初夏皆可开花，且花色种类丰富，被广泛用作风景林地的观赏植物。此外，杜鹃还具有环境监测功能，可以作为NO和NO2等气体的敏感监测树种[ 2 ]。我国从20世纪80年代开始进行杜鹃组织培养的研究，并取得了一定进展。楊乃博等以毛叶杜鹃叶片为外植体培养得到再生植株[ 3 ];有的学者用组培苗的叶片作为外植体进行诱导获得成功[ 4 ];钟宇对西洋杜鹃的茎尖进行培养获得成功[ 5 ];程雪梅对马缨杜鹃的茎尖、茎段、叶片、根等进行组织培养，以建立其快繁技术[ 6 ];宋慧娟和庄雪影对毛棉杜鹃的组织培养条件进行优化[ 7 ];吴影倩等对2种杜鹃杂交种不定芽生根培养基配方进行了优化[ 8 ]。目前，我国已经初步建立了杜鹃组培快繁体系，但杜鹃品种间的差别大、茎叶等外植体消毒难、不定芽分化率低、优良品种生根困难和移栽成活率低等问题，仍是杜鹃花组织培养中急需研究和解决的问题。

试管外生根技术是杜鹃组织培养难题的突破口，它将组培茎芽的生根诱导和驯化培养两个过程合二为一，即直接将无菌茎芽扦插到试管外有菌环境中，在诱导生根的同时进行驯化培养[ 9 ]。目前，以顶芽和腋芽为外植体大量繁殖杜鹃无根茎丛的技术已经成形[ 10 - 15 ]。为了缩短育苗周期，降低生产成本，在短期内得到大量健壮的杜鹃苗，本研究以经壮苗培养的杜鹃无根茎丛为材料，扦插在不同基质上，通过控制基质的含水量和培养条件，找到影响杜鹃试管外生根的主要因素和适合杜鹃试管外生根的最佳条件，进而生产大量苗木以满足日益增大的市场需求，为杜鹃实现产业化生产提供更广泛的理论和实践基础。

1 试验材料与方法

1. 1 试验材料

试验材料为从美国引进的杜鹃杂交种最佳组培系10瓶，品种为Rhododendron'western's Prink Diamond'，是R. dauricum×R. minus×R. mucronatum的杂交种。该杜鹃品种生长旺盛，早春开花，花粉色双边，铃铛状花形;冬季半数叶片呈绿色，其余叶片呈红褐色。该品种兼具有几个亲本的优良特性，可在一定程度上克服杜鹃适应性及抗寒性差的缺陷。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 杜鹃无菌茎芽增壮培养

做无菌茎芽增壮培养时，将杜鹃茎芽从培养瓶中取出，去叶至顶芽处留3～4片小叶。将顶芽剪下并垂直接种到培养基中，剩余部分则剪成1.0～1.5 cm长的茎段，水平接种在培养基上。将杜鹃顶芽和茎段分别接种，每个瓶中接种10个外植体。增壮培养基为：WPM+蔗糖25 g/L+琼脂7 g/L，添加不同浓度的细胞分裂素2-ip（0 μmol/L和0.8 μmol/L），pH值5.8。采用日光灯照射，进行光照培养，每天22 h光照/2 h黑暗或全光照培养，温度25±2 ℃，湿度70%～80%。培养7周后，调查0 μmol/L和0.8 μmol/L浓度2-ip对杜鹃茎芽质量的影响，测定苗高和半木质化的外植体数，然后进行组培茎丛微枝扦插。

1. 2. 2 杜鹃组培茎丛微扦插

在事先浇好水的移栽基质上均匀打出约1.5 cm深的小孔，为了保证生根一致，将杜鹃试管苗去叶至顶芽处保留4～6片叶子，得到约3 cm高的茎芽。将小苗插入基质的孔中，压实后在叶面上喷水盖上盖子培养。培养在25 ℃左右，湿度60%～70%，每天光照16 h/黑暗8 h的培养室中。微扦插时，瓶苗从无菌状态的高温、高湿、弱光的环境过渡到有菌状态的自然条件，为了适应微扦插后的较低湿度以及较强的光照，需先将无菌芽放到炼苗室内炼苗3～7 天。

1. 2. 3 杜鹃无菌茎芽试管外生根

移栽基质的种类和组分决定了该基质的特性，并对无根苗的生根和生长造成直接影响。根据杜鹃喜酸的特性，本试验选用5种移栽基质扦插杜鹃组培茎芽，分别为购自昆明的粗草炭土、购自昆明的细草炭土、购自黑龙江省朗乡林业局的草炭土、购自黑龙江省朗乡林业局的草炭土与沙子等比例混合、纯沙子，将基质分装在培养盒内，基质至盒身高度的3/5处，将其压实，浇水待移栽。按照土壤pH值的测定方法[ 15 ]，测定5种移栽基质的pH值和含水量。按照试验设计开展以下试验：（1）移栽基质试验。在5种基质中进行微扦插培养，每个处理最少130株，设3次重复;培养8周后，调查平均生根率，筛选出最佳移栽基质。（2）基质处理方法试验。采用不同方法处理最佳基质，一是在基质中按比例搅拌菌虫双杀（山东省青州市日中经贸有限公司生产）0.84 g/L，二是对基质进行高温灭菌，三是不处理，每个处理40株，设3次重复;培养8周后，调查平均生根率，筛选出最佳基质处理方法。（3）基质含水率试验。设4种不同含水率，水体积与基质体积之比分别为3∶20，4∶20，5∶20和6∶20，每个处理120株，3次重复。培养6周后，调查试管外生根率和苗高增长量，确定基质最佳含水率。（4）生长调节剂试验。基于以上3项试验得到的最佳基质配置，采用NAA、IBA、ABT1、ABT2和GGR等5种生长调节剂，每种均采用50、100、200和300 mg/L4个水平，每个处理设3次重复，用速蘸法进行微枝扦插，培养8周后，调查试管外生根率、苗高、地径、根数和根长等指标。

2 结果与分析

2. 1 壮苗期2-ip浓度对杜鹃茎芽质量的影响

由不同2-ip浓度对杜鹃茎芽质量的影响（表1）可以看出，壮苗期间添加不同浓度的2-ip，对杜鹃茎芽的生长和增殖影响存在差异。添加0.8 μmol/L 2-ip的无根茎芽，不论是平均苗高还是半木质化百分率，均优于未添加2-ip的处理，因此应在培养基中添加0.8 μmol/L 2-ip。

2. 2 移栽基质对杜鹃组培茎芽试管外生根的影响

据测定，昆明和朗乡纯草炭的pH值均呈酸性，沙子的pH值则接近中性，朗乡草炭和沙子等比例混合的基质pH值居于二者之间。在不同基质中微扦插培养8周后，调查试管外生根率。由不同移栽基质对杜鹃试管外生根率的影响（表2）可以看出，以纯沙子为基质，试管外生根率为8.1%，推测其不适合杜鹃试管外生根;用草炭和沙子为基质，生根率为10.9%;在昆明粗草炭和细草炭2种基质上进行微扦插的杜鹃无根苗，死亡率分别为7.9%和5.4%，虽然死亡率不高，但最终生根率只达到57.4%和40.0%，所以也不是杜鹃试管外生根最佳的移栽基质;在朗乡草炭土上微扦插苗的死亡率仅为9.2%，且平均生根率也最高，说明黑龙江省朗乡草炭土较适合杜鹃无根苗试管外生根。由此可知，购自黑龙江朗乡pH值为5.82的草炭土作为基质最适于杜鹃试管外生根。

2. 3 基质处理方法对杜鹃茎芽试管外生根的影响

由不同基质处理方法对杜鹃试管外生根率的影响（表3）可以看出，在搅拌菌虫双杀0.84 g/L的草炭土基质中微扦插苗平均生根率最高，达到了91.7%;在经过高温灭菌的草炭土基质中的平均生根率为85.0%;在未经任何处理的草炭土基质中的平均生根率只有27.5%。造成生根率过低的原因可能是扦插前基质中含有大量细菌和微生物，杜鹃无根茎芽受到杂菌污染所致。由此可知，搅拌菌虫双杀0.84 g/L的草炭土操作快捷简单，又非常有效。

2. 4 基质含水率对杜鹃试管外生根的影响

由不同含水率基质对杜鹃试管外生根的影响（表4）可以看出，基质的含水率对茎芽试管外生根及小苗生长影响很大，水分过多或过少都对苗的生长产生不利影响。水体积与草炭土体积比分别为3∶20，4∶20，5∶20和6∶20时，对杜鹃试管苗的生根率和平均苗高增长量的影响呈现先增加后降低的趨势。可见，基质含水率过高和过低都不适合杜鹃无根苗的生根和生长，基质中水体积与草炭土体积比为5∶20（含水率75%）时，比较适合杜鹃试管外生根和苗高生长。

2. 5 生长调节剂对杜鹃茎芽试管外生根的影响

由生长调节剂对杜鹃试管外生根及生长情况的影响（表5）可以看出，NAA在各试验浓度的生根率随着浓度的增加呈上升趋势，但平均生根率均小于50%;IBA和ABT1在试验浓度范围内生根率均小于30%;ABT2和GGR较前三者生根率较高，其中当ABT2浓度为50 mg/L时，生根率可达86.4%，GGR对其生根率的影响效果最显著，随着浓度的增加而不断升高，在300 mg/L时生根率达最大值88.6%。

5种生长调节剂对平均根数和平均根长的影响结果差别不明显，平均根数大部分集中在2～4条。GGR在各试验浓度时根数多数为3或4条，其中最多根数有6条，最少的有2条。5种生长调节剂对根长的影响顺序为：IBA>GGR>ABT2>NAA>ABT1;同时，试管外生根苗的苗高受生长调节剂种类和浓度的影响各不相同，除了ABT1处理外，苗高均能达到4～5 cm;ABT2在试验浓度范围内浓度的平均苗高均大于5 cm，GGR在各浓度平均苗高也达到4 cm左右。此外，生长调节剂种类对地径的影响顺序为：GGR>ABT2>IBA>NAA>ABT1。由此可知，在经过GGR和ABT2处理后，幼苗的苗高和地径优于其它3种生长调节剂处理。

经试验，各种浓度的ABT1处理对试验各项指标的效果都不好，ABT2和GGR处理后的生根情况较其它3种生长调节剂好。综合考虑杜鹃茎芽试管外生根率、根数、根长、苗高和地径等指标，300 mg/L GGR处理的杜鹃苗生根率最高达88.6%，苗高可达4.91 cm，地径最粗为0.65 mm，最多根数可达6条，平均根长为1.00 cm。因此，用300 mg/L GGR速蘸茎芽基部是杜鹃试管外生根的最佳处理。

3 结论与讨论

3. 1 采用引进的杜鹃瓶苗，经多次增殖培养，出瓶前经过增壮培养（添加2-ip 0.8 μmol/L的WPM培养基）7～8周，瓶苗出瓶前闭瓶炼苗3～7天（温度为25 ℃左右，湿度为60%～70%，以日光灯照射，较强的光照条件）。扦插时，将杜鹃无根茎芽剪成单株，用生长调节剂GGR以300 mg/L速蘸其基部，然后扦插在事先处理好的纯草炭土，拌入菌虫双杀0.84 g/L，pH值5.8左右，含水率75%左右，在室内组培驯化室进行试管外生根培养，可得到较好的生根效果。

3. 2 进行杜鹃组培微枝试管外生根试验时应注意：在生根期间，每天早晚打开盖子通风，用水喷洒叶面，根据基质的干湿情况进行浇水，始终保证基质潮湿。杜鹃生根很慢，通常1个月后才会有3%～5%的茎丛长根，大部分到6～8周才会陆续生根，逐渐用小镊子将盒盖支起，不断增加光照直到把盒盖完全撤去。生根期间如果基质的湿度过大，1个月后基质表面就会长绿苔，但如果开盖，基质很快会干，没有生根的幼苗会随之干枯，所以控制基质的湿度十分关键。另外，要逐渐增加光照和通风时间，一般4周后幼苗逐渐长出新叶，生根率在80%以上，幼苗叶片翠绿，茎粗壮。

3. 3 不同种类和浓度的生长调节剂对杜鹃试管外生根率的影响并不规律，造成这种现象的原因可能是杜鹃组培茎芽本身木质化程度低，用生长调节剂处理后基部组织受到损伤，不能正常吸收水分和养分，分化根原基进而分化成根，导致扦插后不久有死苗现象。另外，扦插后的管理也很重要，如基质含水率控制不严格也可能造成影响不规律。

参考文献

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第1作者简介：  王爱芝（1975-），  女，  博士，  助理研究员，  主要从事种苗培育原理与技术的研究工作。

通讯作者：  沈海龙（1962-），  男，  博士，  教授，  博士生导师，  主要从事森林培育学的教学和科研工作。

收稿日期： 2020 - 01 - 20

（责任编辑：   王 岩）

Abstract The results of research on influencing factors of Micro-cuttings Ex-vitro rooting of Rhododendron tissue culture showed that substrate type， substrate treatment method， substrate moisture content， and growth regulators all have a great effect on rooting rate. Add 0.8 mol/L of 2-ip to the sterile growth of rhododendron culture for 7～8 weeks. Quickly dip the base of the stem bud with 300 mg / L GGR， and cut into 0.84 g / L of double-killed bacteria pure peat soil （pH value of 5.8 and water content of 75%） ） can be better rooted when cultivated in an indoor tissue culture and domestication room for external rooting.

Key words Rhododendron;  Tissue culture;  Micro-cuttings;  Ex-vitro Rooting