黄连解毒汤对人胃癌SGC-803细胞株作用的实验研究

高东霞1 盖广东1 张士刚2 李加庆3 孙付军4 桑晓光* 殷晓敏 孙通华

1.山东省沂南县妇幼保健院，山东 沂南 276300；2.山东省泰安市中医医院，山东 泰安 271000；3.山东省沂南县人民医院，山东 沂南 276300；4.山东省中医药研究院，山东 济南 250014；5.山东省寿光市人民医院，山东 寿光 262700

胃癌(Gastric Carcinoma, GC)是最常见的消化道系统肿瘤，目前仍是影响全球的一大健康问题，其发病率在肿瘤中高居第五，死亡率高居第三[1]。在我国胃癌发病率也一直居高不下。尽管早期胃癌患者可通过手术治疗，然而胃癌的复发，转移及耐药等问题仍然令人堪忧。中药因其表现出增效减毒作用，是治疗恶性肿瘤中的重要组成部分，因此，寻找一种能够提高治疗胃癌疗效的中药具有重要的意义。

黄连解毒汤由黄连、黄芩、黄柏、栀子组成，是常用清热解毒代表方剂之一，可泻火解毒、凉血止血。现代报道该方含有小檗碱、黄芩素等[2]抗肿瘤活性成分，有明显抑制恶性肿瘤的作用[3]。近年来已有研究把黄连解毒汤用于肿瘤治疗，动物实验证实[4-5]，黄连解毒汤对小鼠体内、体外肿瘤生长均有抑制作用。现为进一步研究黄连解毒汤抗肿瘤疗效，本实验采用体外培养技术，以人胃癌细胞SGC-803模型，探究黄连解毒汤抑制其增殖、迁移及凋亡情况，为黄连解毒汤治疗胃癌的临床应用提供依据。

1 材料

1.1 药物 黄连解毒汤由黄连、黄芩、黄柏、栀子按原方比例(3∶2∶2∶3)配制而成。将全部药物混合，浸泡，煎煮，二煎后均匀混合，置于蒸发仪上，浓缩为1.4 g/mL的黄连解毒汤；药液1200 rpm离心两次后取上清，置于微量离心管，1300 rpm5 min超速离心一次；集上清，0.22 μm 微孔滤膜过滤除菌后于-20 ℃冰箱保存备用。

1.2 细胞株 SGC-803 胃癌细胞株(购于南京凯基生物科技发展有限公司)。

1.3 试剂 胎牛血清(杭州天杭生物科技公司公司)；RPMI-1640 液体培养基(含10%FBS，青霉素100U/L，链霉素100U/L，赛默飞世尔科技公司)；CCK-8试剂盒(亚科因生物技术公司)；AnnexinV/FITC 试剂盒及线粒体膜电位试剂盒(贝博生物公司)；Bcl-2、Bax、Caspase3 等购自武汉三鹰生物技术公司。

2 方法

2.1 细胞培养 选用10%胎牛血清的RPMI-1640培养基进行人胃癌MGC-803细胞培养。在37 ℃、5%CO2的细胞培养箱中培养，每2～3 d传代一次，细胞呈单层贴壁生长，在细胞达到指数增长期时开展实验，制成单细胞悬液，按所需浓度接种使用。

2.2 CCK-8实验检测细胞增殖抑制率 实验共分3组：空白组；对照组：培养基(90%RPMI1640+10%FBS)；实验组：设0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%五个不同中药浓度(用培养基配制)。CCK-8增殖检测试剂盒测定细胞活力，取对数生长期MGC-803细胞制备细胞混悬液；调整细胞浓度为5×104/mL，进行细胞计数；接种于96孔板，每孔加培养液100 μL，每孔细胞数为5000个，每组设平行6个复孔，共铺3块96孔板；按设计对不同实验组细胞进行加药，于培养箱中按不同时间段分别培养24 h、48 h、72 h，检测时吸出相应的96孔板内液体，反应液取CCK-8和培养基以1∶9的比例配置，每孔加入100 μL，继续培养2 h；置于全自动酶标仪中，设定参数(波长490 nm、中等强度震荡10 min)，检测各孔的OD值。实验重复3次，并记录结果。抑制率(%)=[1-(实验组OD值-空白组OD值)/(对照组OD值-空白组OD值)]×100%。

2.3 划痕实验检测细胞迁移率 对照组：RPMI-1640；实验组：黄连解毒汤(浓度：MGC-803细胞用RPMI-1640配制)。调整细胞浓度为1.5×105/mL为细胞计数；将细胞接种于6孔板，每孔2 mL；待细胞密度至70%～80%时，用100μL规格枪头划痕；PBS轻柔洗涤2次，去除漂浮细胞；显微镜拍照记录初始划痕范围；按设计对不同实验组细胞进行加药，继续培养；24 h、48 h后，再次拍照记录细胞划痕范围，计算细胞迁移率。细胞迁移率=迀移距离/划痕宽度×100%

2.4 流式细胞术检测细胞凋亡率 对照组：培养基(90%RPMI1640+10%FBS)；实验组：黄连解毒汤水提物(浓度：MGC-803细胞，用培养基配制)。在含90%RPMI1640+10%FBS的培养液中常规培养细胞，消化细胞，离心5 min，弃上清，收集细胞；用培养基重悬细胞，计数细胞，调整细胞浓度为1.5×105/mL，接种于细胞培养皿中培养细胞，使细胞贴壁，培养至细胞基本覆盖培养皿底部。加入黄连解毒汤的培养液，继续培养。48 h后从培养箱中取出，收集细胞培养液，冷PBS洗涤细胞2次，消化，收集所有细胞。离心，再用PBS洗细胞2次，吸弃PBS。加入400 μL×Binding Buffer缓冲液重悬细胞；将细胞转移至流式管中；加入 Annexin V-FITC和5 μL PI，在避光处轻轻混匀，孵育细胞15 min；1 h内用流式细胞仪检测，记录实验结果。

2.5 qRT-PCR检测细胞相关基因mRNA的表达 对照组：培养基(90%RPMI1640+10%FBS)；实验组：黄连解毒汤(浓度：MGC-803细胞，用培养基配制)。收集黄连解毒汤水提物处理过的MGC-803细胞总RNA，以其反转录合成的cDNA为模板，β-actin为内参进行qRT-PCR 检测，每组实验重复三次。得到的数据采用2-ΔΔCt计算获得细胞中Bcl-2、Bax、Caspase3 mRNA 的相对表达量。利用PrimerPremier5.0软件设计引物，β-actin上游引物为5′-AACAAGATGAGATTGGCA-3′，下游引物为5′-AGTGGGGTGGCTTTTAGGAT-3′；Bcl-2上游引物为5′-CGACTTCGCCGAGATGTCCA-3′，下游引物为 5′-TTGACTTCACTTGTGGCCCA-3′；Bax上游引物为 5′-ATGATTGCCGCCGTGGACAC-3′，下游引物为 5′-CCACCCTGGTCTTGGATCCA-3′；Caspase3上游引物为 5′-CATGGAAGCGAATCAATGGACT-3′，下游引物为 5′-CTGTACCAGACCGAGATGTCA -3′。增反应程序结束后，以2-ΔΔCt方法计算目的基因mRNA相对表达量。

3 结果

3.1 黄连解毒汤不同浓度、时间对MGC-803细胞増殖的抑制率 由表1可知，随着黄连解毒汤用药浓度及用药时间的增加，胃癌MGC-803细胞增殖水平被逐渐抑制，呈现时间及浓度依赖性，与对照组、空白组比较具有显著差异(P<0.01)。

表1 黄连解毒汤不同浓度、时间对MGC-803细胞増殖的抑制率

3.2 黄连解毒汤对MGC-803细胞迁移的影响 由表2可知，在同一作用时间，黄连解毒汤干预的实验组MGC-803细胞的迁移率较对照组显著下降(P<0.01)，提示黄连解毒汤对胃癌MGC-803细胞迁移能力明显抑制。

表2 黄连解毒汤对MGC-803细胞迁移的影响

3.3 黄连解毒汤不同浓度、时间对MGC-803细胞凋亡的影响 由表3可知，流式细胞术检测细胞凋亡结果显示，同一作用时间，不同浓度黄连解毒汤干预下MGC-803细胞的细胞凋亡率均高于对照组(P<0.01)。

3.4 黄连解毒汤对胃癌细胞相关基因mRNA表达的影响 由表4可知，qRT-PCR结果显示，经黄连解毒汤干预后Bax、Caspase3 基因mRNA表达上调，Bcl-2基因mRNA表达下调，与对照组相比，差异具有统计学意义(P<0.05)。

表3 黄连解毒汤不同浓度、时间对MGC-803细胞凋亡的影响

表4 MGC-803细胞相关目的基因mRNA相对表达量

5 讨论

黄连解毒汤，君以黄连入上焦而清心除烦、入中焦而祛湿热之邪；臣以黄芩、黄柏相伍，黄芩以攻中上焦湿热，黄柏以走下焦而除湿热诸证；佐以栀子通泻三焦湿热，引火下行，四药相辅相成，共奏泻火解毒、治疗三焦火毒之效。中医学认为，肿瘤其证多属本虚标实，胃为仓廪之官，受纳腐熟水谷，脾胃运化失司，湿热蕴结，气血热毒瘀滞，胃络被热毒所伤而致血败肉腐，发生病变。黄连解毒汤以清热解毒为法，清解蕴结之热毒，是治疗胃癌的主要治法之一。本实验采用经典的黄连解毒汤干预胃癌MGC-803细胞，该方被证实具有抗肿瘤作用，其有效成分小檗碱、黄芩素等抗肿瘤活性成分，有明显抑制恶性肿瘤的作用，可通过抑制肿瘤细胞分裂，从而抑制其增殖[3]。

研究以人胃癌MGC-803细胞作为研究对象，对黄连解毒汤的抗癌作用及机制进行了相关探索。实验结果表明，随着黄连解毒汤的浓度及用药时间的增加，MGC-803细胞增殖水平被逐渐抑制，且呈现出药物浓度及时间依赖性；在药物作用 24 h、48 h时，MGC-803细胞的早期、晚期凋亡率均有升高，随给药浓度的增高，凋亡率明显上升，由此可见，黄连解毒汤可以有效促进胃癌细胞的凋亡，且可能主要作用于早期凋亡，并呈一定浓度相关性。细胞的增殖与凋亡始终保持动态平衡，可维持细胞群体数量的稳定，当动态平衡被打破，细胞凋亡失常，成为肿瘤形成的重要病理基础之一，参与肿瘤的发生发展过程。认为黄连解毒汤通过抑制胃癌MGC-803细胞增殖，诱导其凋亡，是黄连解毒汤方降低胃癌患者复发率及转移率的重要途径之一。经黄连解毒汤干预后Bax、Caspase3 基因mRNA表达上调，Bcl-2基因mRNA表达下调。报道证实[6]Bax和Bcl-2是Bcl-2蛋白家族成员之一，与细胞凋亡和肿瘤发生发展有关。这与本次研究结果相符，黄连解毒汤可诱导MGC-803凋亡相关蛋白表达水平发生改变，Bcl-2表达量下降，Bax表达量上升，Bcl-2/Bax比值下降。此外，有研究表明，Bcl-2/Bax在线粒体中定位决定凋亡的发生，其比值与凋亡水平有关[7]。以上研究结果表明，黄连解毒汤诱导胃癌细胞MGC-803凋亡，可能是通过线粒体途径。本实验揭示了黄连解毒汤抗胃癌侵袭的作用机制，为开发新型抗胃癌药提供了中药的理论依据，更好的将基础医学研究成果应用至临床工作中，从而建立最有效的治疗手段。

综上所述，黄连解毒汤能够通过诱导细胞凋亡抑制胃癌细胞MGC-803增殖，并且还抑制胃癌细胞迁移能力。此外，还可能通过影响凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax的表达，从而发挥抗肿瘤作用。然而，细胞信号通路极其复杂，对胃癌细胞作用是否还影响信号通路及存在更多的潜在作用机制，目前仍不清楚。尽管如此，研究结果证实了黄连解毒汤具有明显抗肿瘤作用，可能会是治疗胃癌一种新的治疗策略，为临床胃癌治疗提供了实验依据。