枝睾阔盘吸虫凉山分离株18S rRNA基因部分序列测定与种系发育分析

郝桂英，易 利，邓 宇，何学谦

（西昌学院动物科学学院，西昌 615013）

枝睾阔盘吸虫（Eurytrema cladorchis）隶属于吸虫纲（Trematoda）、复殖目（Digenea）、双腔科（Dicrocoeliidae）、阔盘属（Eurytreama）[1]，在牛、羊胰腺胰管内均有寄生，但不如胰阔盘吸虫（E. pancreaticum）、腔阔盘吸虫（E.coelomaticum）常见[2]。牛、羊感染后可引起消瘦、生长发育受阻、生产性能降低等，严重感染时可引起牛、羊死亡，给养殖业造成一定的经济损失。

根据形态学特征可以对枝睾阔盘吸虫进行初步鉴定，但由于受宿主、环境等多种因素的影响，其准确性、可靠性受到一定的限制。DNA技术已被广泛应用于寄生虫的分类学研究，其中DNA序列分析由于操作简单、结果准确可靠、提供的信息丰富，成为研究分类学和种系发生学的有力工具之一[3]。

核糖体DNA（rDNA）基因具有高度保守性，在所有细胞生物中都存在，进化具有良好的时钟性质，其序列中不同位置上变化的速度不同。18S rRNA 基因是真核生物染色体上编码核糖体小亚基RNA的基因，该基因序列高度保守，常用来分析物种系统进化关系[4]。目前已广泛应用于寄生虫分子分类研究，如鸡球虫[5]、兔球虫[6]、马梨形虫[7]等。用于胰阔盘吸虫和腔阔盘吸虫分子分类的靶基因主要有18S rRNA[8-10]、ITS2[10]，已有胰阔盘吸虫核糖体DNA全序列的报道[11]。但关于枝睾阔盘吸虫分子分类的研究仅见孟加拉共和国瘤牛源枝睾阔盘吸虫18S rRNA和ITS2的报道[12]。

鉴于此，本研究对采自四川省凉山彝族自治州的9个山羊源枝睾阔盘吸虫样品的18S rRNA基因部分序列进行PCR扩增和序列分析，并构建枝睾阔盘吸虫与其他吸虫的种系发育关系，从而明确18S rRNA基因能否成为枝睾阔盘吸虫理想的遗传标记，为今后枝睾阔盘吸虫的分子分类和种群遗传结构研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 虫体的采集及保存枝睾阔盘吸虫样品采自四川省凉山彝族自治州自然感染的9只山羊胰管内，用灭菌生理盐水清洗干净，进行形态学鉴定后，分别编号为LS01～LS09，于-20℃保存备用。分离自同一只山羊的枝睾阔盘吸虫为1个分离株。

1.2 主要试剂蛋白酶K购自Merck公司，2×TaqPCR Master Mix、DL2000 DNA marker、GreenView核酸染料、柱式DNA胶回收试剂盒等均购自天根生化科技（北京）有限公司。

1.3 枝睾阔盘吸虫虫体总DNA提取从冷冻保存的9个山羊源枝睾阔盘吸虫样品中分别随机取出1条，用剪刀剪碎并研磨，加入SDS（1 μg/μL）裂解液和蛋白酶K（10 μg/μL），放入56℃水浴锅中消化过夜，然后将消化好的虫体悬液用酚/氯仿法[13]提取虫体总DNA，保存于-20℃备用。

1.4 枝睾阔盘吸虫18S rRNA基因的扩增及序列测定用Zheng等[9]报道的引物进行枝睾阔盘吸虫18S rRNA基因部分序列的扩增。引物序列分别为18SP1：5'-GGCTCATTAAATCAGCTGGTT-3'；18SP2：5'-ACGTTTTACTTCCTCT AAAT-3'。引物序列由上海杰李生物技术有限公司合成。

PCR扩增体系为50 μL：2×TaqPCR Master Mix 25 μL，引物18SP1、18SP2（10 pmol/L）各2 μL，模板DNA 2 μL，ddH2O 19 μL。同时，以ddH2O作空白对照。扩增条件：94℃预变性5 min；94℃变性40 s，55℃复性45 s，72℃延伸110 s，35个循环；72℃延伸6 min。反应结束后分别取5 μL PCR扩增产物用10 g/L琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像系统检测目的条带的大小。各PCR扩增产物经柱式DNA胶回收试剂盒进行回收纯化后送上海杰李生物技术有限公司测序。

1.5 序列分析及系统进化分析检索GenBank收录的部分吸虫18S rRNA基因序列并下载（表1），然后用Clustal X 1.81软件进行序列比对，MEGA 5.0软件分析碱基组成、转换/颠换比率，基于K2P模型计算遗传距离。用DNAStar 中的MegAlign程序进行序列同源性分析。用DnaSP 4.0软件计算单倍型数（haplotypes，H）、核苷酸多样性（Nucleotide diversity，Pi）、单倍型多样性（Haplotypes diversity，Hd）和平均核苷酸差异（average number of nucleotide differences，K）。

以猪带绦虫（Taenia solium，DQ157224）作为系统发育分析的外群，采用K2P模型，用MEGA 5.0软件构建NJ树，并进行重复1000次的自举检验（bootstrap test）。

表1 部分吸虫18S rRNA基因序列信息Table 1 Sequences information of 18S rRNA gene of different flukes

2 结果与讨论

2.1 枝睾阔盘吸虫18S rRNA基因的序列特征和同源性比较经比对校正剔除多余序列后，本研究测得的9个枝睾阔盘吸虫凉山州分离株的18S rRNA基因部分序列长度均为1758 bp，A+T碱基的平均含量为47.8%，低于肉牛源胰阔盘吸虫齐齐哈尔分离株18S rRNA基因全序列（1996 bp）A+T碱基的平均含量（49%～49.1%）[11]，也与斜睾亚目吸虫18S rRNA基因序列A+T碱基的平均含量（48.18%～49.23%[17]）的结果不一致，这可能与序列长度、宿主、地理位置等有关。9个测序序列均不存在碱基插入/缺失，其中保守位点1753个，变异位点5个（简约信息位点1个、单变异位点4个）。核苷酸变异位点发生在密码子的第三位（占60%）和第一位（占40%）。序列中颠换多于转换，转换/颠换（R）平均值为1.064，3个颠换（2个G-C、1个T-G）和2个转换（C-T）。

9个枝睾阔盘吸虫凉山州分离株测序序列的核苷酸同源性为99.9%～100%，碱基变异率为0～0.1%。9个测序序列与已知枝睾阔盘吸虫的同源性最高（99.7%～100%），与鹿前后盘吸虫的同源性最低（92.6%～92.7%），与胰阔盘吸虫的同源性为99.4%，与腔阔盘吸虫的同源性为99.1%～99.2%，与矛形双腔吸虫的同源性为97.9%～98.0%，与东方双腔吸虫、分叶短腺吸虫的同源性均为98.0%～98.1%，与愁体吸虫的同源性为98.5%～98.6%，与华支睾吸虫的同源性为93.9%～94.0%，与肝片吸虫、大片吸虫的同源性为92.9%～93.0%。9个测序序列与枝睾阔盘吸虫、胰阔盘吸虫、腔阔盘吸虫的碱基差异分别为0～0.3%、0.6%、0.8%～0.9%，与愁体吸虫、分叶短腺吸虫、矛形双腔吸虫、东方双腔吸虫的差异分别为1.4%～1.5%、2.0%、2.0%～2.1%和2.0%，与其他学者的报道稍有差异。郑亚东等[8]报道腔阔盘吸虫18S rRNA基因部分序列与愁体吸虫、矛形双腔吸虫的差异分别为1.75%、2.42%。安徽省和福建省腔阔盘吸虫和胰阔盘吸虫的18S rRNA基因序列分别有3个和4个碱基的差异[18]。巴西牛源的3个腔阔盘吸虫18S rRNA基因片段（528 bp）核苷酸同源性为100%，与腔阔盘吸虫中国分离株、胰阔盘吸虫中国分离株的同源性分别为99.8%和99.4%[19]；5个肉牛源胰阔盘吸虫齐齐哈尔分离株的18S rRNA基因全序列（1996 bp）的碱基变异为0～0.2%[11]。因此，18S rRNA基因可以作为阔盘属吸虫分子分类理想的遗传标记基因。

2.2 遗传多样性分析9个山羊源枝睾阔盘吸虫18S rRNA基因序列共检测到3个单倍型，遗传距离为0～0.003，平均遗传距离为0.001。与已知枝睾阔盘吸虫参考序列的遗传距离为0～0.001，与胰阔盘吸虫的遗传距离为0.005～0.006，与腔阔盘吸虫的遗传距离为0.008，与矛形双腔吸虫、东方双腔吸虫、分叶短腺吸虫的遗传距离为0.019～0.020，与愁体吸虫的遗传距离为0.014～0.015，与华支睾吸虫、肝片吸虫、大片吸虫、鹿前后盘吸虫的遗传距离≥0.062。碱基序列总的单倍型多样性（Hd）和核苷酸多样性（Pi）分别为0.417和0.00073，平均核苷酸差异（K）为1.278。可见枝睾阔盘吸虫凉山州分离株的变异程度较低。

2.3 系统发育分析基于18S rRNA基因部分序列（1447 bp）构建的NJ树显示：9个山羊源枝睾阔盘吸虫凉山州分离株与瘤牛源枝睾阔盘吸虫孟加拉共和国分离株亲缘关系最近，聚在同一小支上；然后与牛源胰阔盘吸虫福建分离株、牛源腔阔盘吸虫福建分离株聚类形成阔盘属分支，再与愁体吸虫聚为一支，分叶短腺吸虫与双腔属的矛形双腔吸虫、东方双腔吸虫聚在另一小支上。从图1可看出阔盘属与愁体吸虫的亲缘关系最近，而分叶短腺吸虫与双腔属的亲缘关系更近。与其他学者报道的结果相似，Figueira等[19]基于18S rRNA基因片段（528 bp）构建的系统发育树显示3个巴西分离株与腔阔盘吸虫、胰阔盘吸虫和愁体吸虫聚在同一支上，且与腔阔盘吸虫和胰阔盘吸虫的亲缘关系更近，与矛形双腔吸虫和东方双腔吸虫亲缘关系远，与大片吸虫的亲缘关系最远。常巧呈等[10]基于18S rRNA基因的部分序列（1200 bp）构建的系统发育树证实阔盘属和双腔属的亲缘关系密切。Su等[11]基于18S rRNA基因全序列构建的系统发育树显示胰阔盘吸虫位于斜睾亚目双腔科的分支上，与后睾亚目的亲缘关系最近，与传统形态学分类结果一致。

本研究对采集自凉山州山羊源的枝睾阔盘吸虫18S rRNA基因的部分序列进行PCR扩增和序列分析，结果发现凉山州枝睾阔盘吸虫18S rRNA基因存在一定程度的遗传变异，但遗传变异较低。研究结果进一步支持了18S rRNA基因是复殖目吸虫分类鉴定的理想分子标记。

图1 基于18S rRNA基因部分序列采用NJ法构建的枝睾阔盘吸虫系统发育树（支持率标注在分支上）Fig.1 Phylogenetic tree of E. cladorchis based on partial sequences of 18S rRNA gene by NJ method（Numbers on the branches indicated the supporting value）