补骨脂种子提取物与丙硫菌唑复配对桃褐腐病菌的增效作用

王晓琳 孙伟波 李朝辉 黄洁雪 邬劼 吉沐祥

摘要：以桃褐腐病病菌（Monilinia fructicola）为供试菌，采用菌丝生长速率法，测定腈苯唑、补骨脂种子提取物、丙硫菌唑、咯菌腈、氟啶胺和吡唑醚菌酯对桃褐腐病病菌的毒力。结果表明，5种化学杀菌剂对桃褐腐病病菌的抑制中浓度最低的是丙硫菌唑，其EC50仅为0.003 5 μg/mL，其次是腈苯唑，其EC50为0.003 8 μg/mL，抑制中浓度最高的为吡唑醚菌酯，其EC50为0.576 7 μg/mL。在离体条件下测定补骨脂种子提取物与丙硫菌唑配比筛选试验，结果表明，当补骨脂种子提取物与丙硫菌唑的质量比为10 ∶1时，EC50仅为0.010 4 μg/mL，SR值为3.744 5;比例为1 ∶1和 1 ∶5 时SR次之，分别为2.875 2和2.056 4。综合离体试验结果和经济因素，确定补骨脂种子提取物与丙硫菌唑防治桃褐腐病病菌的最佳比例为1 ∶1。

关键词：补骨脂种子提取物;丙硫菌唑;桃褐腐病病菌;复配;增效作用

中图分类号： S436.621.1+3文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2020）18-0114-05

收稿日期：2019-11-21

基金项目：江苏省重点研发计划（编号：BE2018389）;国家重点研发计划（编号：2018YFD0201400-2）。

作者简介：王晓琳（1986—），女，辽宁营口人，硕士，助理研究员，主要从事应时鲜果病虫草害防治研究。E-mail：morethan365@126.com。

通信作者：吉沐祥，研究员，主要从事果树植保与农药开发研究。E-mail：jilvdun2800@163.com。

桃人工栽培历史悠久，距今已有4 000多年历史，是我国主要水果之一。桃褐腐病是由子囊菌链核盘菌（Monilinia spp.）侵染造成的，桃褐腐病通常发生在开花旺盛期和采收前，危害桃树叶片、花朵、枝条和果实，引起腐烂枯死，环境条件适宜时会在采后桃贮藏、运输和销售中发生，导致桃果实产量和品质受到严重影响[1-2]。目前，防治桃褐腐病的主要手段是化学防治，主要杀菌剂有三唑类、苯丙咪唑类、二甲酰亚胺类和甲氧基丙烯酸酯类等。何献声通过试验19种杀菌剂对桃褐腐病离体抑菌活性发现，啶菌唑和腈苯唑对桃褐腐病离体抑菌活性较为突出，10 mg/L质量浓度下，啶菌唑和腈苯唑对桃褐腐病病菌菌丝生长抑菌率达100%[3]。纪兆林等通过采用菌丝生长抑制法测定8类15种杀菌剂对桃褐腐病病菌的毒力效果发现，毒力作用最强的是咪鲜胺，其次是己唑醇[4]。周莹等通过研究几种杀菌剂对桃褐腐病的毒力测定及田间控制作用发现，甲基硫菌灵和复配杀菌剂克菌·戊唑醇对大连地区桃褐腐病病菌具有较强毒力[5]。由于长期使用单一作用位点的杀菌剂，会使病原菌对杀菌剂产生抗药性。陈淑宁通过研究桃褐腐病病菌对甾醇脱甲基抑制剂类（DMI）杀菌剂的抗性发现，采自云南省的16株桃褐腐菌株中，15株对多菌灵产生抗性，并且和乙霉威产生负交互抗性[6]。

相关研究表明，利用生物农药或植物源杀菌剂能够安全有效地控制植物病害。侯旭等发现，从桃树根部组织中分离到的内生拮抗真菌ZJ-4菌株对桃褐腐病病原菌的生长有明显的抑制作用[7]。纪兆林等通过研究发现，地衣芽孢杆菌菌株W10菌液及其产生的抗菌蛋白对贮藏期桃褐腐病有较好的抑制作用，高浓度效果更好，W10菌液和抗菌蛋白浸果处理能显著降低贮藏期的桃自然腐烂率，与多菌灵效果相当[8]。袁雪等从高产桃园土壤中分离、筛选得到特基拉芽孢杆菌菌株B-23，以1×109 CFU/mL 菌悬液处理桃果实、叶片和枝条，对桃褐腐病抑制率分别为74.5%、83.3%和60.0%[9]。补骨脂种子提取物是沈阳同祥生物农药有限公司2019年登记的植物源农药，其有效成分可通过破坏病原菌的细胞膜、线粒体膜、核膜等膜系统和干扰细胞代谢过程而达到杀菌的目的。丙硫菌唑是拜耳公司开发的新型广谱三唑硫酮类杀菌剂[10]，属甾醇脱甲基化（麦角甾醇的生物合成）抑制剂。具有选择性、保护性、治疗性和持效性等特點，2019年在我国的2家公司：安徽久易农业股份有限公司和山东海利尔化工有限公司取得登记。本研究选用植物源农药补骨脂种子提取物与丙硫菌唑复配，明确2种药剂的最佳配比，旨在为桃褐腐病的防治提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试菌株

桃褐腐病菌（M. fructicola）采自江苏省溧水白马基地桃园，由扬州大学园艺与植物保护学院分离、鉴定并保存备用。菌株保存于马铃薯蔗糖琼脂（PDA）斜面上（4 ℃）。实验室内在PDA培养基平板上转接1次后，于25 ℃预培养3 d，从菌落边缘取直径5 mm菌丝块用于测定。

1.1.2 试验时间与地点

本试验于2019年4—6月在江苏丘陵地区镇江农业科学研究所中心实验室进行。

1.1.3 供试药剂 供试药剂详见表1。

1.2 试验方法

1.2.1 药液的配制及浓度设计

将试验药剂用蒸馏水溶解，配制成1 000 μg/mL的母液。

桃褐腐病病菌不同药剂单剂的浓度设计见表2。

补骨脂种子提取物、丙硫菌唑与不同配方的浓度设计见表3。

单剂与复配剂的浓度设计均为6个2倍稀释的梯度浓度含药PDA培养基，所有试验药剂系列浓度的药液均为现配现用。

1.2.2 杀菌剂对桃褐腐病病菌室内毒力测定

25 ℃ 条件下培养3 d后利用十字交叉法测量各处理菌落直径，以不含杀菌剂的PDA培养基为对照，每处理重复4次。计算出药剂的抑制百分率，按毒力回归方程Y=a+bx计算药剂抑制菌丝生长的有效中浓度（EC50），作为毒力参数。计算公式为D=D1-D2。式中：D为菌落增长直径;D1为菌落直径;D2为菌饼直径）。I=（D0-Dt）/D0*100%。式中：I为菌丝生长抑制率;D0为空白对照菌落增长直径;Dt为药剂处理菌落增长直径。

1.2.3 杀菌剂对桃褐腐病病菌的最佳配比离体试验筛选

采用机率值分析法计算每个杀菌剂对靶标菌菌丝生长的有效抑制中浓度，并通过下面公式计算混合药剂的增效系数（SR）。

EC50（Exp）=a+baEC50（A）+bEC50（B）;

SR=EC50（Exp）EC50（Obs）。

式中：字母a代表药剂A在混合药剂中所占的比例;字母b代表药剂B在混合药剂中所占的比例;EC50 （Obs）为实际测定的混合药剂对病原菌的抑制中浓度;EC50（Exp）为混合药剂对病原菌的理论抑制中浓度。通过上面2个公式计算得每个设定比例的配方的SR值，SR>1.5说明2种药剂复配具有增效作用，0.5≤SR≤1.5说明2种药剂之间复配具有相加作用，SR<0.5表明2种药剂为拮抗作用[11]。

2 结果与分析

2.1 室内抑菌活性测定

2.1.1 不同种类杀菌剂对桃褐腐病病菌菌丝生长的抑制作用

从表4可以看出，当腈苯唑为 0.006 25～0.200 00 μg/mL时，对桃褐腐病病菌菌丝生长的抑菌率为85.53%～100%;当补骨脂种子提取物为0.375～12.000 μg/mL时，对桃褐腐病病菌菌丝生长的抑菌率为42.76%～67.43%;当丙硫菌唑为0.006 25～0.200 00 μg/mL时，对桃褐腐病病菌菌丝生长的抑菌率为88.49%～100%;当咯菌腈为 0.062 5～2.000 0 μg/mL时，对桃褐腐病病菌菌丝生长的抑菌率为67.76%～100%;当氟啶胺为 0.031 25～1.000 00 μg/mL时，对桃褐腐病病菌菌丝生长的抑菌率为65.78%～100%;当吡唑醚菌酯为0.375 ～12.000 μg/mL 时，对桃褐腐病病菌菌丝生长的抑菌率为57.04%～100%。

不同杀菌剂对桃褐腐病病菌的毒力测定结果见表5，对桃褐腐病病菌抑制中浓度最低的是丙硫菌唑，其次是腈苯唑。6种单剂的活性（EC50）分别为丙硫菌唑（0.003 5 μg/mL）>腈苯唑（0.003 8 μg/mL）>氟啶胺（0.042 2 μg/mL）>咯菌腈（0.084 0 μg/mL）>吡唑醚菌酯（0.576 7 μg/mL）>补骨脂种子提取物（1.679 2 μg/mL）。

2.1.2 补骨脂种子提取物与丙硫菌唑对桃褐腐病病菌菌丝生长的抑制作用

从表6可以看出，当补骨脂种子提取物为0.375～12.000 μg/mL时，对桃褐腐病病菌菌丝生长的抑菌率为22.54%～8350%;当丙硫菌唑为0.003 125～0.100 000 μg/mL时，对桃褐腐病病菌菌丝生长的抑菌率为56.40%～100%;当补骨脂种子提取物与丙硫菌唑配比10 ∶1的浓度为0.006 25～0.200 00 μg/mL 时，对桃褐腐病病菌菌丝生长的抑菌率为42.12%～99.33%;当补骨脂种子提取物与丙硫菌唑配比为5 ∶1的浓度为0003 125～0.100 000 μg/mL 时，对桃褐腐病病菌菌丝生长的抑菌率为6.31%～85.77%;当补骨脂种子提取物与丙硫菌唑配比1 ∶1的浓度为 0001 562 5～0.050 000 0 μg/mL 时，对桃褐腐病病菌菌丝生长的抑菌率为44.91%～99.02%;当补骨脂种子提取物与丙硫菌唑配比1 ∶5的浓度为0001 562 5～0.050 000 0 μg/mL 时，对桃褐腐病病菌菌丝生长的抑菌率为64.24%～100%;当补骨脂种子提取物与丙硫菌唑配比1 ∶10的浓度为0001 562 5～0.050 000 0 μg/mL 时，对桃褐腐病病菌菌丝生长的抑菌率为65.52%～100%。

将表4中筛选的补骨脂种子提取物和丙硫菌唑进行复配，采用Wedley法确定其最佳配比（表7）。由毒力回归曲线方程、抑制中濃度和SR值可以得出补骨脂种子提取物与丙硫菌唑的比例在10 ∶1时，SR值最大，为3.74，此时EC50为0.010 4 μg/mL。比例在1 ∶1、1 ∶5和1 ∶10时SR值比较大，分别为2875 2、2.056 4和1.979 7，所以根据试验结果和从价格方面考虑，推荐补骨脂种子提取物与丙硫菌唑以1 ∶1复配。

3 讨论

目前，农业生产已进入新时代，从关注作物自身安全转为保障整个农业生产加工系统的可持续性，寻找新的高效、低毒和环境相容性好的杀菌剂是当前研究的趋势，一些中草药提取物具有杀菌作用，对人体和环境无危害，增加了对水果食用的安全性。植物源杀菌剂指的是从具有杀菌、抑菌活性的天然植物的某些部位提取有效成分，将其分离纯化然后经过加工得到的药剂。关丽杰等通过液体培养方法研究补骨脂提取物对苹果腐烂病病菌菌丝生长的抑制作用发现，当补骨脂提取物浓度为 80 mg/L 时，对苹果腐烂病病菌菌丝干质量的抑制率达98.3%[12]。关丽杰等采用菌丝生长速率法、孢子萌发法，研究补骨脂提取物对黄瓜炭疽病病菌菌丝生长的抑制中浓度（EC50）为62.973 mg/L，孢子萌发的抑制中浓度为8.213 mg/L[13]。本试验通过菌丝生长速率法测定补骨脂种子提取物抑制桃褐腐病病菌菌丝生长的EC50为1.679 2 μg/mL。相比于传统的三唑类杀菌剂，丙硫菌唑在化学结构中引入硫酮结构，杀菌谱更广，内吸性更好，持效期更长。据相关报道，丙硫菌唑对小麦赤霉病[14]、人参菌核病[15]、水稻恶苗病[16]、梨树褐斑病、黑星病、白粉病[17] 等有很好的防治效果，在桃褐腐病上的防治应用还未见报道。本研究6种杀菌剂对桃褐腐病病菌的毒力测定结果表明，抑制中浓度最低的是丙硫菌唑，5种化学农药单剂的活性（EC50）分别为丙硫菌唑（0.003 5 μg/mL）>腈苯唑（0.003 8 μg/mL）>氟啶胺（0.042 2 μg/mL）>咯菌腈（0.084 0 μg/mL）>吡唑醚菌酯（0.576 7 μg/mL）。

药效增效复配可以完善植物源活性物质与活性成分研究的技术体系，突破植物源农药产品剂型单一、多为单剂的现状，推动及促进我国植物源农药的产业化发展。本研究通过试验和综合经济因素得出，补骨脂种子提取物和丙硫菌唑杀菌剂以 1 ∶1 的比例混合，在离体条件下对桃褐腐病病菌具有增效作用，为有效的防治桃褐腐病提供了依据，以便更好地为农业服务，其在田间的实际防治效果还有待进一步的试验验证。

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