乳酸菌发酵黑莓汁增加胞外多糖工艺初探

戴意强 单成俊 刘小莉 吴寒 王英 程先玲 郜海燕 韩延超 周剑忠 夏秀东

摘要：为增加黑莓汁中乳酸菌胞外多糖含量，利用产胞外多糖乳酸菌MB2-1和JX5发酵黑莓汁，并测定发酵过程中黑莓汁的pH值、黏度及多糖含量随时间的变化情况，以确定用于发酵黑莓汁的乳酸菌种类和碳源。结果表明，添加葡萄糖作为碳源时，乳酸菌MB2-1和JX5发酵在32 h时胞外多糖产量最高，分别为2.75 g/L和3.06 g/L，说明将乳酸菌JX5作为发酵菌株，葡萄糖作为碳源添加到黑莓汁中进行发酵，可增加黑莓汁中乳酸菌胞外多糖含量。

关键词：乳酸菌;黑莓汁;多糖;碳源;发酵;黏度

中图分类号： TS275.5文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2020）18-0214-05

收稿日期：2019-09-11

基金项目：江苏省科技计划（编号：BE2018367）;江苏省农业科技自主创新资金[编号：CX（18）2017];农业农村部果品产后处理重点实验室、浙江省果蔬保鲜与加工技术研究重点实验室开放课题。

作者简介：戴意强（1995—），男，江苏南京人，硕士研究生，研究方向为食品生物技术。E-mail：yq-dai@foxmail.com。

通信作者：夏秀东，博士，副研究员，研究方向为食品生物技术。E-mail：86084056@163.com。

黑莓浆果风味独特、营养丰富，含有多种具有生物活性的化合物，是酿酒和生产果汁、果酱、医疗保健品等的天然原料。黑莓中富含维生素C、酚酸、鞣花酸、鞣花素、类黄酮（包括花青素）和类胡萝卜素等促进健康的物质，具有抗氧化、代谢调节、消除疲劳、延缓衰老、提高免疫力等作用[1-2]。因此随着人们生活水平的提高和对健康生活的追求，研究和开发黑莓相关的产品将具有广阔的前景。

胞外多糖（EPS）是一类由特殊微生物在生长代谢过程中分泌到细胞壁外的一类次级代谢产物[3]。EPS具有多种生理活性功能，可以增强机体免疫力，具有抗肿瘤、降低血清中胆固醇[4]、降血压、抗氧化和改善人体肠道微生态环境[5]等作用。乳酸菌EPS是一类来源可靠安全，对人体无毒副作用，并且具有独特的理化和流变学特性的物质，因此可以作为增稠剂、稳定剂、乳化剂应用到食品工业中，已经成为了一种天然安全无公害的食品级添加剂[6]。

笔者研究了2株产胞外多糖乳酸菌在添加不同碳源的条件下发酵黑莓汁中pH值、黏度和产胞外多糖情况，以期開发一种新型产胞外多糖乳酸菌发酵黑莓汁饮料。

1 材料与方法

1.1 试验材料

黑莓来源于江苏省南京市溧水区白马种植基地;植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）JX5，由江苏省农业科学院农产品加工研究所食品生物工程研究室保存;瑞士乳杆菌（Lactobacillus helveticus）MB2-1，由南京农业大学食品科技学院食品微生物研究室保存。

1.2 试剂及仪器

试剂：MRS肉汤培养基（北京奥博星生物技术有限公司）;浓硫酸（南京化学试剂股份有限公司）;苯酚、无水乙醇（国药集团化学试剂有限公司）。

仪器：3K15离心机[西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司];DV-1+Pro黏度计（上海尼润智能科技有限公司）;FiveEasy Plus pH计[梅特勒-托利多国际贸易（上海）有限公司];Epoch酶标仪（美国伯腾仪器有限公司）;Agilent 1290高效液相色谱（安捷伦科技有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 黑莓果汁制备工艺

黑莓果汁制备工艺流程如下：黑莓浆果清洗→打浆→离心取上清→加入碳源（3%葡萄糖、3%蔗糖、1%乳糖）→85 ℃ 巴氏杀菌 20 min→接种→发酵→85 ℃巴氏杀菌 20 min→成品。

1.3.2 乳酸菌培养及对黑莓汁的接种

挑取活化好的乳酸菌单菌落接种到液体MRS培养基中，37 ℃培养48 h。将一定体积含乳酸菌的MRS液体培养基离心去上清，用无菌水洗涤沉淀2次，再加入同体积无菌水，混匀，按3%的接种量分别接种到处理过的黑莓汁中。

1.3.3 黑莓汁中糖分组成和含量的测定

样品经 11 000 r/min 离心后过0.45 μm滤膜，稀释10倍后测定糖分组成。用超纯水配制10 mg/mL棉子糖、蔗糖、葡萄糖、木糖和果糖母液，待用。标准液浓度依次为1.0、0.8、0.4、0.2、0.1 mg/mL。以进样量为横坐标、峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。

色谱分析条件为流动相：超纯水;流动相流速：0.5 mL/min;色谱柱：Agilen Hi-Plex Ca糖分析柱;检测器：示差折光检测器;柱温：80 ℃;进样量：25 μL。

1.3.4 发酵黑莓汁pH值的测定

将发酵0、32、120 h的黑莓汁摇匀后，用pH计测定不加入碳源、加入葡萄糖、蔗糖以及乳糖的发酵黑莓汁pH值。

1.3.5 发酵黑莓汁黏度的测定

用量筒量取 30 mL 发酵0、32、120 h的黑莓汁，用黏度计测定不加入碳源、加入葡萄糖、蔗糖以及乳糖的发酵黑莓汁的黏度，转子型号为0号转子，转速为 60 r/min。

1.3.6 发酵黑莓汁多糖含量的测定

采用苯酚-硫酸法测定发酵黑莓汁中的多糖含量。称取样品1.0 g（精确至0.001）置于50 mL具塞离心管中，缓慢加入20 mL无水乙醇，涡旋振荡，混匀，4 ℃提取 1 h，再用4 000 r/min的转速离心10 min，弃上清液。不溶物用80%乙醇溶液洗涤、离心，用去离子水将沉淀超声溶解后再次离心，取上清液，残渣用去离子水洗涤2次。将所有上清液转入到50 mL容量瓶中，加去离子水定容。

分别吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL标准葡萄糖溶液置于20 mL具塞试管中，并用蒸馏水补足至10 mL。向试样中先后加入1.0 mL苯酚和5.0 mL浓硫酸，混匀后于30 ℃下水浴20 min，并于490 nm处测定吸光度。

2 结果与分析

2.1 黑莓汁中糖分组成和含量

利用液相色谱仪测定黑莓汁中糖分组成和含量，结果发现，所用品种的黑莓汁中糖分组成为葡萄糖和果糖。图1是糖类标准品的色谱峰，棉子糖、蔗糖、葡萄糖、木糖、果糖分离效果好，保留时间分别为11.503、12.452、13.604、15.028、16.920 min。黑莓汁中糖分的HPLC分析结果见图2，可以看出，糖分分离效果很好，根据出峰时间可知，黑莓汁中含有葡萄糖和果糖。根据葡萄糖标准曲线（y=174 121.422 16x-1 214.766 07， r2=0.996 3）和果糖标准曲线（y=224 217.087 47x-1 650.563 79，r2=0.997 7）得到，黑莓汁中葡萄糖和果糖含量分别为26.70 mg/mL和20.97 mg/mL。说明黑莓汁中含有丰富的糖分，不添加糖分或者添加适量的糖分即可满足乳酸菌生长代谢所需。

2.2 发酵黑莓汁pH值变化

乳酸菌可以利用糖类发酵产酸，但由于对不同糖类的利用能力有所不同，乳酸菌在不同碳源下的生长状况和产酸能力不同。

本研究探讨了不同碳源对产胞外多糖乳酸菌MB2-1发酵黑莓汁pH值的影响（图3-A）。与发酵0 h的pH值相比，相同碳源下乳酸菌MB2-1发酵黑莓汁在32、120 h时的pH值显著增加（P<005）;除添加葡萄糖和乳糖的黑莓汁外，相同碳源下发酵黑莓汁pH值在32、120 h 之间无显著性差异（P>0.05）。添加不同的碳源和不添加糖分之间在0、32 h时发酵液pH值无显著性差异（P>0.05）。乳酸菌MB2-1发酵黑莓汁在发酵过程中pH值维持在2.98～3.26范围内。

乳酸菌JX5发酵添加不同碳源的黑莓汁pH值变化，图3-B所示。乳酸菌JX5发酵黑莓汁在 0 h 时pH值维持在3.0左右;发酵32 h时，不添加碳源或者添加葡萄糖、乳糖作为碳源之间pH值无显著差异（P>0.05），而添加蔗糖的发酵黑莓汁pH值较低。与发酵32 h时添加乳糖的发酵黑莓汁pH值相比，發酵120 h时添加乳糖的发酵黑莓汁pH值显著降低（P<0.05）。除添加乳糖的发酵黑莓汁外，32 h 和120 h发酵黑莓汁pH值无显著性差异（P>005）。

在添加碳源和不添加碳源的情况下，与0 h的pH值相比，乳酸菌MB2-1和乳酸菌JX5发酵黑莓汁pH值在32 h时显著上升（P<0.05），这可能是因为一方面随着发酵时间的增加，黑莓汁中碳源含量减少限制了乳酸菌的生长，且乳酸菌在衰退期菌体发生自溶，氨基氮含量增加，造成pH值上升。另一方面可能由于发酵过程中乳酸菌将黑莓汁中的有机酸消耗或转化为其他有机酸。

2.3 发酵黑莓汁黏度变化

乳酸菌发酵过程中一般采用间接的方法来定量测定EPS的产量[7]，其中对黏度的测定就是一种间接测定方法，但是黏度和EPS产量没有必然的对应关系[8-9]。

不同碳源对乳酸菌MB2-1发酵黑莓汁黏度的影响如图4-A所示。在0 h时，不添加碳源和添加葡萄糖、蔗糖、乳糖的黑莓汁黏度分别为5.39、587、5.73、5.35 cp。在32 h时，发酵黑莓汁黏度显著下降（P<0.05），分别下降为4.99、515、4.79、4.87 cp。与发酵32 h时的发酵黑莓汁相比，发酵120 h时不添加碳源和添加葡萄糖的发酵黑莓汁黏度显著增加（P<0.05），而添加蔗糖的发酵黑莓汁黏度显著降低（P<0.05）。

如图4-B所示，乳酸菌JX5发酵黑莓汁在不添加碳源和添加葡萄糖、蔗糖、乳糖情况下起始黏度分别为5.22、5.67、5.40、5.40 cp;在32 h时，发酵黑莓汁黏度分别为5.00、5.36、5.09、4.98 cp。与发酵32 h时的发酵黑莓汁相比，乳酸菌JX5发酵120 h后，不添加碳源和添加葡萄糖的黑莓汁黏度显著上升（P<0.05），分别为5.74 cp和5.75 cp。除添加蔗糖和乳糖的黑莓汁外，乳酸菌MB2-1和乳酸菌JX5发酵黑莓汁黏度随时间的增加先减小后增大，这可能是由于乳酸菌生长前期利用黑莓汁中如糖类等具有黏度的营养物质，导致发酵黑莓汁整体黏度下降，而发酵后期，发酵黑莓汁中产生了其他具有黏性的物质，如乳酸菌胞外多糖等。值得注意的是在MB2-1和JX5发酵120 h后添加蔗糖发酵黑莓汁黏度显著下降，这可能是因为黑莓汁中的微生物利用了黑莓汁中存在的多糖。

2.4 发酵黑莓汁多糖含量变化

乳酸菌胞外多糖是乳酸菌在生长代谢过程中分泌到细胞外部的糖类化合物。由图5可知，是否加入碳源或者加入不同的碳源，乳酸菌发酵黑莓汁多糖含量随时间的增加先增加后减少，这是因为乳酸菌在发酵过程中会产生多糖，当黑莓汁中营养物质被消耗殆尽时，多糖可能被再次利用。在添加葡萄糖、蔗糖、乳糖情况下，乳酸菌MB2-1和乳酸菌JX5发酵黑莓汁中多糖含量在32 h时显著上升（P<0.05），分别为2.75、2.69、2.41 g/L和3.06、2.52、2.50 g/L。乳酸菌MB2-1和乳酸菌JX5发酵添加不同碳源的黑莓汁在0 h时多糖含量无显著性差异（P>0.05）。在添加葡萄糖、蔗糖、乳糖情况下，乳酸菌MB2-1和乳酸菌JX5发酵黑莓汁在120 h 时多糖含量显著下降（P<0.05），分别为160、1.13、161 g/L和1.47、1.27、1.82 g/L。由图5可知，乳酸菌MB2-1和乳酸菌JX5在添加葡萄糖作为碳源时，发酵32 h的黑莓汁中胞外多糖含量