固相萃取-高效液相色谱法同时测定果蔬中吡虫啉和多菌灵残留量

杨宇霞 韩建欣 李 慧 赵 欣

（山西省生物研究院有限公司，山西太原 030006）

吡虫啉（Imidacloprid） 又名海正吡虫啉，化学名称为1-（6-氯吡啶-3-吡啶基甲基） -N-硝基亚咪唑烷-2-基胺，属硝基亚甲基类内吸杀虫剂，主要用于防治刺吸式口器害虫及其抗性品系。多菌灵（Carbendazim） 又名棉萎灵，化学名称为N-（2-苯骈咪唑基） -氨基甲酸甲酯，是一种苯并咪唑类杀菌剂，主要用于防治由真菌引起的病害。吡虫啉和多菌灵均为新一代内吸性杀菌剂，具有广谱、高效、低毒的特点，被广泛用于蔬菜、水果的病虫害防治上，其残留会对人体造成一定的危害。因此，改进吡虫啉和多菌灵残留的检测方法、提高检测效率十分必要。

目前，我国已颁布了多项吡虫啉和多菌灵残留检测标准，主要检测方法有高效液相色谱法、液相色谱串联质谱法。液质联用法虽然有较低的检出限，但仪器价格昂贵、技术要求较高、普及度不够；高效液相色谱法因其定性定量准确可靠、仪器价格适中，成为现在普遍采用的方法，然而现行标准都只是针对其中的某一种进行测定，且前处理较繁琐复杂。因此，本文通过对样品前处理方法和HPLC 分析条件的优化，建立了同时检测果蔬中吡虫啉和多菌灵残留量的高效液相色谱法，方法简便、高效，能满足日常检测的需求。

1 材料与方法

1.1 试剂与材料

吡虫啉、多菌灵标准品，农业部环境保护科研监测所；乙腈（色谱纯），霍尼韦尔贸易（上海）有限公司；甲醇（色谱纯），赛默飞世尔科技（中国） 有限公司；二氯甲烷（分析纯），天津市光复科技发展有限公司；试验用水为超纯水。

试样材料购于太原农贸市场。

1.2 仪器与设备

Agilent 1100 型高效液相色谱仪，美国安捷伦科技公司；T10 分散机，广州仪科实验室技术有限公司；TG16-GS 高速离心机，长沙湘智离心机仪器有限公司；AL204 电子天平，梅特勒-托利多仪器上海有限公司；MS3 digital 漩涡混合器，广州仪科实验室技术有限公司；ASE-24 固相萃取装置，天津奥特赛恩斯仪器有限公司；GM-1.0A 隔膜真空泵，天津市津腾实验设备有限公司；KD200 氮气吹扫仪，杭州奥盛仪器有限公司；Cleanert-NH2 固相萃取柱（500 mg/6 mL），天津博纳艾杰尔科技有限公司；NW150V 型超纯水系统，上海康雷分析仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 标准溶液的配制

吡虫啉标准中间液的配制：吸取一定量吡虫啉储备液，用甲醇溶解并稀释成10 μg/mL 的标准中间液，密封，于4 ℃冰箱中贮存。

多菌灵标准中间液的配制：吸取一定量多菌灵储备液，用甲醇溶解并稀释成50 μg/mL 的标准中间液，密封，于4 ℃冰箱中贮存。

混合标准溶液的配制：准确吸取吡虫啉中间液0.02 mL、0.05 mL、0.10 mL、0.20 mL、0.50 mL、1.0 0mL，多菌灵中间液0.01 mL、0.02 mL、0.10 mL、0.20 mL、0.50 mL、1.00 mL 分别加入6 个10 mL 容量瓶中，用流动相稀释至刻度，即配成吡虫啉质量浓度分别为0.02 μg/mL、0.05 μg/mL、0.10 μg/mL、0.20 μg/mL、0.50 μg/mL、1.00 μg/mL，多菌灵质量浓度分别为0.05 μg/mL、0.10 μg/mL、0.50 μg/mL、1.00 μg/mL、2.50 μg/mL、5.00 μg/mL 的混合标准使用液，密封，于4 ℃冰箱中贮存。

快递属于技术含量较低、市场准入门槛不高的行业，由于从业人员的素质、经营管理方式等问题，导致了目前快递业很难给用户提供稳定而有效的服务。少数企业片面追求经济利益，服务内容和方式过于简单，在解决消费者纠纷时，态度较差，不管有没有责任先推诿，这些都导致部分用户对快递企业不满，甚至引发矛盾升级。规范快递行业经营秩序，保障整个市场健康发展，已事在必行。同时，针对无照经营的”黑”快递，执法部门应加大联合监管执法力度，加强政府监督，从而营造合法有序的快递市场环境，更加有效地保护消费者的合法权利。

1.3.2 样品制备

称取蔬菜、水果样品可食部分约300 g，将其切碎，用搅拌机粉碎，装入容器，密封备用。

1.3.3 样品提取

准确称取25.00 g 试样，置于250 mL 高型烧杯中，加入50 mL 乙腈，4-5 档高速匀浆2 min 后，于10 000 r/min 离心10 min，上清液转移到装有5 g氯化钠的具塞量筒中，剧烈振荡2 min，室温下静置分层。

1.3.4 样品净化

取10 mL 上清液于刻度试管中40 ℃氮气吹至近干。加入2.0 mL 甲醇-二氯甲烷（1+99） 溶解残渣，涡漩2 min，待净化。将氨基柱用4.0 mL 甲醇-二氯甲烷（1+99） 预洗活化，当溶剂液面到达柱吸附层表面时，立即加入上述待净化液，收集洗脱液于13 mL 刻度试管中，用2.0 mL 甲醇-二氯甲烷（1+99） 润洗刻度试管后过柱，重复2 次。将洗脱液于40 ℃氮气吹至近干，用流动相溶解定容至2.5 mL，涡漩2 min 后，用孔径0.22μμm 有机滤膜过滤，上机检测。

1.3.5 色谱条件

色谱柱：Agilent Eclipse Plus C18（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇-水（32∶68）；流速：1.0 mL/min；柱温：40 ℃；检测波长：270 nm；进样量：20 μL。

2 结果与分析

2.1 样品前处理条件的优化

分别采用匀浆和匀浆加超声2 种方法进行提取试验，结果表明，2 种方法处理的结果无明显差异，回收率均符合试验要求，故选择操作简单、省时的匀浆作为最终提取方法。

2.1.2 净化条件的选择

选择C18小柱和氨基小柱为固相萃取柱进行净化试验，经试验表明，氨基柱处理除杂质比较彻底、干扰少、重复性好，因此选择氨基柱作为固相萃取小柱。

2.2 色谱条件的优化

2.2.1 色谱柱的选择

分别考察了Agilent TC-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）和Agilent Eclipse Plus C18柱对吡虫啉和多菌灵的分离效果。结果显示，在相同色谱条件下，Eclipse Plus 柱的分离效果较好，且柱压较低、保留时间较短，故选择Eclipse Plus 柱作为试验用色谱柱。吡虫啉和多菌灵混合标准溶液色谱图见图1。

2.2.2 流动相组成及比例的选择

分别以甲醇、水和乙腈、水为流动相进行试验，试验结果表明，乙腈水为流动相时，吡虫啉的保留时间短，很难与其他杂质干扰峰彻底分离，故选择甲醇水作为流动相组成。

固定甲醇水作为流动相组成，分别考察了比例为30∶70、32∶68、35∶65、40∶60 的条件下，对分离效果的影响。结果表明，比例为40∶60 时，吡虫啉由于保留时间太短，易受其他杂质峰的干扰，分离度较差。随着甲醇比例的减少，保留时间延长，分离度增大，当达到32∶68 时，吡虫啉与多菌灵的保留时间和分离效果均达到理想状态。随着甲醇比例的继续减少，保留时间继续延长，灵敏度降低，因此最终选择甲醇和水比例为32∶68 作为试验条件。

2.3 方法的线性关系与检出限

分别对各系列浓度的混合标准工作溶液进行测定，以色谱峰面积Y 对其质量浓度X（μg/mL） 进行线性回归，绘制标准曲线，以3 倍信噪比对应的含量计算吡虫啉、多菌灵检出限（S/N=3），线性方程、相关系数和检出限见表1。结果表明，吡虫啉在0.02 μg/mL～1.00 μg/mL、多菌灵在0.05 μg/mL～5.00 μg/mL 范围内线性关系良好，相关系数R≥0.999 9。

表1 线性回归方程、相关系数和检出限

2.4 准确度与精密度试验

采用在样品中加标的方法进行回收率与精密度的测定。分别添加0.05 μg/g、0.10 μg/g、0.20 μg/g 3个水平的标准品，按照本研究优化的方法进行加标回收率试验，每个加标水平平行测定6 次，精密度和回收率结果见下页表2。由表2 可以看出，蔬菜、水果样品中吡虫啉、多菌灵在0.05 μg/g～0.20 μg/g添加水平下，回收率为85.1%～100.5%，相对标准偏差在1.6%～6.6%之间，该方法测定吡虫啉、多菌灵残留量准确度和精密度良好。

图1 吡虫啉和多菌灵混合标准溶液色谱图

表2 精密度和回收率结果（n=6）

3 结论

建立了固相萃取-高效液相色谱同时测定水果、蔬菜中吡虫啉和多菌灵残留量的方法。通过对前处理过程和色谱条件的优化，确定了最佳提取、净化条件和色谱条件。在设定的色谱条件下，吡虫啉和多菌灵的检出限为0.005 μg/g 和0.019 μg/g，相关系数达0.999 9 以上，回收率为85.1%～100.5%，相对标准偏差在1.6%～6.6%之间，该方法简便、高效，适用于果蔬中吡虫啉和多菌灵残留量的同时测定。