一种含有霉菌的茯砖茶中冠突散囊菌的计数方法

刘相真 ，王静，王瑾 ，徐建峰 *

（1.中华全国供销合作总社杭州茶叶研究院，浙江杭州 310016；2.国家茶叶质量监督检验中心，浙江杭州 310016）

近年来，随着人们生活水平的提高，高血压、高血脂和高血糖，已经成为威胁人类健康的“头号杀手”。 中国卫生部公布的数据显示，我国“三高”人群数量已逾3 亿，死亡率近30%。茯砖茶是黑茶的一种，是以黑毛茶为原料，经过紧压过程而制成的再加工茶[1]。茯砖茶之前主要销售于边疆地区如新疆、甘肃、西藏等地，俗称“边茶”或“边销茶”，是边疆少数民族不能缺少的常用饮品[2]。“金花”的学名为冠突散囊菌， 是散囊菌目发菌科散囊菌属的一种真菌，是茯砖茶生产过程中的优势菌种，也是形成茯砖茶独特品质的主要因素[3]。 大量文献表明，茯砖茶中的“金花”有较强的降血脂、调节糖类代谢、调节肠道菌群、提高机体免疫力、减肥等功效，因此，茯砖茶越来越受到大众的青睐[4]。作为茯砖茶的标志性微生物， 在茯砖茶的国家标准和地方标准中都有要求。在1988、2002、2013 年发布的三版茯砖茶的国家标准中， 冠突散囊菌一直是茯砖茶的理化指标之一， 茯砖茶含有冠突散囊菌的量必须达到或高于20×104CFU/g （1988 年版为30×104CFU/g）。

茯砖茶的加工需要经过原料处理、渥堆汽蒸、压制定型、发花干燥、成品包装等工序[5]，传统茯砖茶生产过程是多种微生物共同参与发酵的过程。多名学者[6-13]长期研究发现不同产地、不同时间生产的茯砖茶中均有大量微生物存在。

在 GB/T 9833.3—2013《紧压茶 第 3 部分：茯砖茶》中规定，冠突散囊菌的检测按GB 4789.15—2016 《食品安全国家标准 食品微生物学检验 霉菌和酵母计数》中的规定执行。 实际检测过程中，由于某些茯砖茶中其他菌类的存在， 且其生长速度较冠突散囊菌快，抑制了冠突散囊菌的生长，导致检测时不能真实得到冠突散囊菌的含量。 试验基于GB 4789.15—2016 方法的基础上，针对含有除冠突散囊菌外存在较多杂菌的茯砖茶样品，进一步优化前处理方式（不同温度、不同培养基的培养试验），以寻求合适的方法对冠突散囊菌进行科学计数。

1 材料与方法

1.1 主要仪器设备

博迅100 级超净工作台， 上海一恒BPMJ-150F 恒温培养箱，上海申安DSX-280A 高压灭菌锅，精宏DK-S22 电热恒温水浴锅，宁波立诚LC-11L 拍打式无菌均质器， 马头牌BP- II 型架盘药物天平。

1.2 材料与试剂

一次性培养皿；无菌均质袋；无菌锥形瓶：容量 500 mL，250 mL； 无菌吸管：1 mL （具 0.01 mL刻度）、10 mL（具 0.1 mL 刻度）、无菌平皿：直径90 mm、无菌试管：10 mm×75 mm；孟加拉红琼脂培养基， 青岛高科技工业园海博生物技术有限公司；察氏培养基，青岛高科技工业园海博生物技术有限公司；氯化钠，西陇科学股份有限公司。

1.3 培养基的制备

孟加拉红培养基（g/L）：蛋白胨 5.0，葡萄糖10.0，磷酸二氢钾 1.0，硫酸镁（无水），琼脂 20.0，孟加拉红 0.033，氯霉素 0.1。 察氏培养基（g/L）：硝酸钠3.0，磷酸氢二钾1.0，硫酸镁0.5，氯化钾0.5，硫酸亚铁0.01，蔗糖30.0，琼脂15.0。 高盐察氏培养基（g/L）：在察氏培养基的基础上加入6%的氯化钠。

1.4 样品制备

将茯砖茶样品在干净无污染工作台上剪碎并混合均匀。 称取25 g 茯砖茶样品于无菌均质袋中，加入225 mL 无菌稀释液，用拍击式均质器拍打 1～2 min 后， 置于水浴锅中处理 30 min， 每隔10 min 搅拌一次，得到原液。用无菌稀释液分别制备 10-3、10-4、10-5等各梯度的稀释液， 用于倾注法涂布于平板。

1.5 菌落培养和技术

待琼脂凝固后，正置平板，置28±1 ℃霉菌培养箱中培养，观察并记录至第7 天的结果。 选取菌落数量在10 CFU 至100 CFU 之间，且无蔓延菌落的平板来记录冠突散囊菌总数，每个梯度两个平行样，取平均值，以平均菌落数乘以稀释倍数计算。

2 结果与分析

2.1 冠突散囊菌的正常菌落形态

冠突散囊菌菌落在孟加拉红培养基上的菌落形态如图1 所示， 菌落呈较规则圆形， 质地较致密，有黄色晕圈，边缘淡黄色，近于橄榄浅黄色，中央部分颜色较深近于橄榄褐至丁香褐色， 呈现大量黄色菌丝，老后变成褐色，且伴有水滴状存在。

图1 冠突散囊菌在孟加拉红培养基上的菌落形态Fig. 1 Colony morphology of Eurotium Cristatum on Rose Bengal Medium

2.2 国标方法处理菌落生长情况

从图2 中可知， 选取的茯砖茶样品从外观上能明显看到除了“金花”外，同时含有其他霉菌的存在（白色毛状）。 当按照 GB 4789.15—2016 方法进行培养时，结果如图3 所示，2 天后就已长满了毛霉， 并且旺盛生长的毛霉会抑制冠突散囊菌的生长。因此，国标方法对此类样品存在一定的局限性， 导致对该茯砖茶中真实存在的冠突散囊菌计数结果比实际结果少。

图2 茯砖茶茶样Fig. 2 Fuzhuan Tea sample

图3 国标方法处理的生长情况Fig. 3 The growth of microorganism by GB 4789.15—2016

2.3 水浴温度处理对冠突散囊菌生长的影响

在样品制备阶段进行一定温度的水浴处理，可以有效灭活其他杂菌，便于冠突散囊菌的计数。因此， 做不同水浴温度处理下冠突散囊菌在不同培养基上生长情况的单因素试验， 通过观察冠突散囊菌在培养基的生长情况， 选择合适的培养基和水浴温度。

2.3.1 孟加拉红培养基上生长情况

样品前处理过程中， 水浴的温度分别设定为50 ℃、60 ℃、70 ℃，水浴后的样品稀释 10-4后在孟加拉红培养基上的生长情况如图4 所示。 可看到水浴温度50 ℃处理的样品在孟加拉红培养基上的培养结果稍好于按照国标方法检测的结果；水浴温度60 ℃和70 ℃处理后的样品在孟加拉红培养基上的培养结果较理想，无杂菌生长，冠突散囊菌菌落形态较好，呈较规则圆形，且伴有水滴状存在，但水浴温度60 ℃处理在孟加拉红培养基上的冠突散囊菌计数明显多于水浴温度70 ℃的处理。此结果与杨抚林等[12]对冠突散囊菌在120 ℃高温条件下处理20 min 依旧具有生物活性较一致。

图4 不同处理条件后的样品匀液在孟加拉红培养基上生长情况Fig. 4 Growth of sample homogenates on Rose Bengal Medium under different treatments

2.3.2 察氏培养基上生长情况

水浴后的样品稀释10-3后在察氏培养基上的生长情况如图5 所示。从图5 中可知，不同水浴温度处理后在察氏培养基上均有杂菌生长， 且冠突散囊菌的菌落形态不佳， 对计数有一定影响。 因此，在此实验方案下，察氏培养基不适合用于冠突散囊菌的检测。

2.3.3 高盐察氏培养基上生长情况

水浴后的样品在稀释10-3后高盐察氏培养基上的生长情况如图6 所示。 水浴温度50 ℃处理时， 有少量杂菌生长， 冠突散囊菌菌落形态已呈现；水浴温度60 ℃和70 ℃处理时，已无杂活菌生长，冠突散囊菌菌落形态较好，但水浴温度60 ℃处理在高盐察氏培养基上的冠突散囊菌计数明显多于水浴温度70 ℃的处理。 对比图5 与图6 可得，由于高盐的作用，菌落生长明显受到抑制。

图5 不同处理条件后的样品匀液在察氏培养基上生长情况Fig. 5 Growth of sample homogenates on Czapek Dox Medium under different treatments

图6 不同处理条件下在高盐察氏培养基的生长情况Fig. 6 Growth of sample homogenates on Salt Czapek Dox Medium under different treatments

2.4 最佳培养基的选择

根据单一因素实验结果分析可得， 经水浴温度50 ℃处理，有不同程度的杂菌在不同的培养基上生长；而经水浴温度60 ℃和70 ℃处理，能够有效消除杂菌的干扰。水浴温度60 ℃处理在孟加拉红培养基上的冠突散囊菌计数明显多于水浴温度70 ℃的处理，说明水浴温度70 ℃处理时，能够有效消除杂菌的干扰， 但对冠突散囊菌也有一定的灭活作用。 高盐察氏培养基在样品不经水浴时也能有效抑制毛霉和根霉。 因此，对比60 ℃水浴处理后用孟加拉红培养基培养以及高盐察氏培养基培养， 并对冠突散囊菌进行计数以得出最佳实验方案，结果如图7 和表1 所示。

表1 不同实验条件下冠突散囊菌菌落总数Table 1 The total plate count of Eurotium Cristatum under different experimental conditions

图7 不同实验条件下冠突散囊菌的生长情况Fig. 7 Growth of Eurotium Cristatum under different treatment conditions

由表1 可知，以上四种方法都能较好地抑制杂菌并有效地对冠突散囊菌进行计数， 方案1 所得的冠突散囊菌最多。 虽然用高盐察氏培养基也能对冠突散囊菌进行计数， 但冠突散囊菌的生长受到很大的抑制，因此，方案1，即经60 ℃水浴、0.5 h 再用孟加拉红培养基进行培养为该茯砖茶冠突散囊菌计数的最佳方案。

3 讨论

随着茯砖茶保健功效的不断证实， 已经逐步成为大众饮品，茯砖茶中“金花”的多少又直接关系到它的保健功效的强弱，因此，对于“金花”计数的需求也越来越强烈。 文章只针对该种含杂菌较多的茯砖茶样品进行了试验， 得到了最佳计数方案，当含有其他杂菌的茯砖茶需要“金花”计数时，仍需要进行试验讨论并解决。