小黄鱼内脏油的提取及其棕榈酸甘油酯低温结晶富集工艺的研究

许 韬,周晓红,陈玉洁,刘同杰,易华西,李思铭,肖光辉,公丕民,张兰威,*,冷友斌,*

(1.中国海洋大学食品科学与工程学院,山东青岛 266042;2.青岛中心医院,山东青岛 266042;3.中国飞鹤有限公司,北京 100015)

人乳脂肪的甘油三酯的sn-2位上含有大量的棕榈酸(简称sn-2棕榈酸,>50%),这种特殊位置的棕榈酸对婴儿有着促进脂质吸收和避免Ca2+流失的功能[1]。尽管目前市售配方奶粉对此有所改善,但sn-2棕榈酸的含量仍与人乳有很大差距[2],主要原因是没有合适的富含sn-2棕榈酸的可食用油脂配料。海鱼鱼油中棕榈酸同样大量分布在sn-2位[3],可以作为一种潜在新型富含sn-2棕榈酸的油脂资源,改善目前配方奶粉的不足。

小黄鱼(Larimichthyspolyactis)是我国沿海四大经济海产品之一,年产量高[4]。研究表明,海鱼鱼油含有大量多不饱和脂肪酸,具有丰富的营养和保健功能,对婴幼儿的大脑、神经系统和视网膜的发育具有积极作用[5];对成年人有预防心血管疾病、降低血脂、减少动脉粥样硬化发生等作用[6]。而小黄鱼内脏等部位大部分作为饲料或被直接丢弃,造成了资源的严重浪费与环境污染[7]。从小黄鱼的加工下脚料中提取鱼油的文献较少,仅见刘艳国等人对小黄鱼内脏油的酶法提取工艺进行了研究[7]。鱼油作为经济原料,传统的提取方法有蒸煮法、超临界流体萃取法、稀碱水解法、酶解法和微波辅助法等,不同的提取方法对内脏油的提取效果和脂肪酸组成有影响[8-9]。在鱼油加工方面,研究者更多地关注于鱼油中DHA和EPA的富集,尚未见对棕榈酸富集的报道,所以对鱼油中棕榈酸的富集进行研究,有利于提高鱼油的利用价值。

本文采取稀碱水解法、酶解法和微波辅助法提取小黄鱼内脏油,利用气相色谱对内脏油脂肪酸组成进行检测分析,比较不同方法的鱼油提取率和分析棕榈酸含量和分布的差异,并利用低温结晶传质模型对棕榈酸的富集工艺进行研究,为小黄鱼内脏油的综合开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

小黄鱼内脏 购自青岛市市南区团岛农贸市场,剔除胆囊后洗净搅碎,冷冻干燥后粉碎,于-80 ℃冰箱内贮藏待用;37种脂肪酸甲酯混标(色谱纯)、胰脂肪酶(分析纯) 上海Sigma公司;正己烷 色谱纯,德国Meker公司;甲醇、冰醋酸、乙醚、三氯甲烷、石油醚、盐酸、氢氧化钠、氢氧化钾、氯化钾、氯化钙、胆酸钠 均为分析纯,国药集团化学试剂有限公司;碱性蛋白酶(2×105U/mL) 诺维信生物技术有限公司。

FA2204B电子精密天平 上海天美天平仪器有限公司;SHA-C水浴恒温振荡器 常州市中捷实验仪器制造有限公司;QPro-M微波发生器 加拿大Questron公司;EYEL4 N-1300旋转蒸发器、TG20KR-D离心机 东旺仪器有限公司;GC 6890气相色谱仪 Agilent公司。

1.2 实验方法

1.2.1 小黄鱼内脏含油量测定 准确称量小黄鱼内脏5 g,参照《GB 5009.6-2016》索氏提取法提取小黄鱼内脏油,称重。

1.2.2 小黄鱼内脏油的提取方法

1.2.2.1 稀碱水解法 准确称量小黄鱼内脏5 g,加入去离子水25 mL,用20%的KOH溶液调节pH=7.5,在60 ℃下反应40 min,随后加入KCl盐析15 min。趁热离心(8000 r/min,10 min),分离上层油脂溶于石油醚中,旋转蒸发至恒重,得到小黄鱼粗鱼油,称重,计算小黄鱼内脏油的提取率[10]:

小黄鱼内脏油提取率(%)=碱法内脏油质量(g)×100/国标法的提油量(g)

1.2.2.2 微波辅助法 准确称量小黄鱼内脏5 g,加入50 mL正己烷,在200 W的微波功率下萃取10 min。随后蒸干溶剂,得到油脂,计算小黄鱼内脏油的提取率[11]。

1.2.2.3 酶解法 准确称量小黄鱼内脏5 g,加入去离子水25 mL,用20%的KOH溶液调节pH=8.0,再加入0.180 mL碱性蛋白酶,在50 ℃下酶解2.5 h后灭活,8000 r/min离心10 min,分离上层油脂溶于石油醚中,旋转蒸发至恒重,得到小黄鱼粗鱼油,称重,计算小黄鱼内脏油的提取率[12]。

1.2.3 鱼油理化指标 参照《GB 5009.239-2016》检测鱼油的酸价AV;参照《GB/T 5532-2008》检测碘值IV;参照《GB 5009.227-2016》检测过氧化值POV。

1.2.4 色谱分析 按照Chen等[13]方法制备sn-2位甘油酯并对油脂进行甲酯化。

1.2.4.1 甲酯化 油脂样品10 mg与0.6 mL的0.5 mol/L的NaOH-甲醇溶液在100 ℃下反应5 min。然后加入14% BF3,在100 ℃下反应30 min。用200 μL正己烷萃取出脂肪酸甲酯,保存在棕色色谱小瓶内,然后上机检测。

1.2.4.2 sn-2位单甘酯的制备 将20 mg油脂样品与0.6 mL 1 mol/L Tris-HCl缓冲液(pH=8)、0.06 mL CaCl2溶液(22%)和0.15 mL胆酸钠(0.1%)混匀,然后加入6 mg胰脂肪酶,在45 ℃下反应10 min。灭活后加入0.2 mL乙醚萃取sn-2甘一酯。收集乙醚,点在薄层层析板上,用正己烷/乙醚/乙酸(50∶50∶1,v/v/v)作为展开剂分离单甘酯。将sn-2单甘酯按照1.2.4.1步骤进行甲酯化,待上机检测。

1.2.4.3 气相色谱条件 色谱柱为安捷伦HP-5 INNOWAX毛细管柱(30 m×0.25 mm× 0.2 μm)。进样器温度250 ℃,FID检测器温度250 ℃;载气为氮气;进样量为1 μL,不分流,恒定流速0.8 mL/min;初始温度170 ℃,维持5 min,之后以1.5 ℃/min的速率升温至220 ℃,保持10 min。通过标准品的保留时间鉴定脂肪酸种类,脂肪酸的含量百分比(简称脂肪酸含量)釆用面积归一化法确定。

1.2.5 低温结晶

1.2.5.1 油液比确定 准确称量小黄鱼内脏油2 g,采用正己烷作为溶剂,在温度-60 ℃、时间4 h下,按不同油液比(1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10)低温处理,析出脂肪晶体(简称晶体),称量晶体质量[14],并检测此时脂肪酸成分,分析棕榈酸的含量。

1.2.5.2 低温结晶传质模型 准确称量小黄鱼内脏油2 g,采用正己烷作为溶剂,在不同温度下(-20、-40、-60、-80 ℃),低温一定时间(1、2、3、4、24 h),称量晶体质量,并检测此时的棕榈酸含量。

按照Morales-Medina等人的研究,溶剂中油脂在低温时结晶的传质模型是一个关于时间和温度的函数[15],如公式(1):

式(1)

式中:m-晶体质量(g);t-时间(h);T-温度(K);meq-恒定温度结晶平衡时晶体质量(g);kG·A-模型传质系数(h-1),是一个只与温度T相关的常数。

当温度T恒定时,kG·A和meq均为常数,该模型函数变成只与时间t相关。再通过实验测得不同时间下的晶体质量,就得到晶体质量m对时间t方程m(t)。

棕榈酸含量的模拟方程Wp(t)按公式(2)和(3)得到。公式(2)中棕榈酸的预测质量mp由晶体质量m和棕榈酸含量Wp的乘积得到[16],然后带入公式(1)得到棕榈酸质量-时间模型方程mp(t)。公式(3)中棕榈酸含量对时间的模拟方程Wp(t)为棕榈酸质量的模型方程mp(t)和晶体质量模型方程m(t)之比。

式(2)

式(3)

最后通过MATLAB软件绘制不同温度下棕榈酸含量对时间的方程Wp(t)的图像,求解棕榈酸含量的理论最大值,同时得到棕榈酸富集的理论最佳结晶温度和时间,最后通过平行实验验证理论最佳温度、时间条件的正确性。

1.2.5.3 得率计算公式 晶体得率(%)=晶体质量×100/结晶前内脏油质量

棕榈酸得率(%)=晶体棕榈酸质量×100/内脏油棕榈酸预测质量

1.3 数据处理

所有试验进行3次平行试验,应用SPSS软件分析显著性差异;应用graphpad prism 7.0软件统计画图,应用MATLAB R2018a软件绘制模型的方程图像。

2 结果与分析

2.1 不同方法提取小黄鱼内脏油的提取效果与品质

索氏提取法提取小黄鱼内脏的含油量为0.2595±0.018 g/g内脏粉。其他方法(碱法、酶法和微波法)提取小黄鱼内脏油的结果如表1所示,碱法鱼油的提取率84.26%±5.15%要显著高于酶法鱼油和微波法鱼油(P<0.05)。另外,三种方法得到的小黄鱼内脏油均符合SC/T 3502-2016粗鱼油一级标准。碱法鱼油的三种指标AV(1.41±0.16)、IV(149.37±4.72)和POV(3.27±0.21)都低于酶法和微波法(P<0.05),并且气味和颜色更淡,更容易被接受。

表1 三种方法提取的小黄鱼内脏油的提取率和理化指标

2.2 不同提取方法的内脏油脂肪酸组成分析比较

三种方法提取的小黄鱼内脏油脂肪酸组成如表2所示。对于检出的30种脂肪酸的含量中,碱法鱼油和酶法鱼油有6种存在统计学差异(P<0.05),而两者与微波鱼油相比,超过20种脂肪酸含量存在显著差异(P<0.05),表明提取方法对小黄鱼内脏油的脂肪酸组成有影响。

表2 小黄鱼内脏油的脂肪酸组成(%)

PUFA含量是衡量鱼油价值的重要指标,对降脂抗炎、健智益脑、预防癌症有积极作用[17-18]。碱法鱼油中PUFA含量20.43%±0.55%、ARA含量1.16%±0.02%和DHA含量10.47%±0.28%,均要高于另外两种方法。可能长时间加热或者高能量的微波场,导致PUFA的损失[11]。另外,PUFA含量的ω-3/ω-6比值在推荐值0～15之间时,越高对健康越有利[19],所以碱法鱼油的此比值更合理。虽然碱法鱼油中SFA含量37.70%±0.40%和棕榈酸含量26.47%±0.25%为三者最低,但与另外两种方法在含量上无显著差异(P<0.05)。因此碱法鱼油具有更佳的品质和营养价值。

2.3 sn-2位脂肪酸组成

脂肪酸的位置对其吸收有着重要影响。棕榈硬脂经常应用到配方奶粉中,正是因为sn-2位高含量的棕榈酸[20]。三种方法提取的内脏油sn-2位脂肪酸检测结果见表3。

由表3可知,碱法鱼油中棕榈酸在sn-2位的含量占比最高,达到39.94%±1.11%,是一种sn-2棕榈酸潜在资源;相对棕榈酸含量50.55%±1.06%,显著高于酶法和微波法(P<0.05)。相对棕榈酸含量是表示相对所有棕榈酸而言,分布在sn-2位的棕榈酸含量。而分布在甘油三酯sn-1,3位的棕榈酸消化时首先成为游离脂肪酸,在婴儿的小肠内易形成高熔点的钙皂,影响Ca2+和脂肪酸的吸收[7]。所以相对棕榈酸含量越高,功能性棕榈酸越多,对婴儿健康越有利。碱法鱼油中相对棕榈酸含量与人乳水平(>65%)最为接近,高于市售配方奶粉的20%～35%[21]。因此碱法鱼油中高含量的sn-2棕榈酸和相对棕榈酸可以应用到配方奶粉中,改善其不足问题。

表3 小黄鱼内脏油的sn-2脂肪酸组成(%)

因此,综合提取效果、品质、PUFA、sn-2棕榈酸和相对棕榈酸等因素,碱法鱼油比酶法鱼油和微波鱼油具有更大的营养价值和开发利用潜力,将作为低温结晶富集棕榈酸所用的原料油脂。

2.4 低温结晶富集棕榈酸

小黄鱼内脏油中棕榈酸的含量不到30%,为了提高其含量和利用价值,需对棕榈酸进行富集。低温结晶法工艺简单,可以最大程度地保留分离组分的结构[22],即最大程度地保留sn-2棕榈酸的结构和功能性。因此采用低温结晶法富集内脏油中的棕榈酸,对富集的最佳工艺条件进行研究。

2.4.1 油液比对富集的影响 在结晶温度为-60 ℃、时间4 h的条件下,研究油液比对晶体得率和棕榈酸得率的影响,结果如图1所示。晶体的形成与溶液的饱和度相关[23]。虽然1∶4时晶体得率最高,但棕榈酸得率并不高,当油液比为1∶6时,棕榈酸的得率最高,对棕榈酸的富集效果最好。因此选择1∶6为最适油液比。

图1 油液比对晶体得率的影响(A)和对棕榈酸得率的影响(B)

2.4.2 晶体的传质模型

2.4.2.1 不同温度下的晶体质量-时间曲线 在油液比1∶6,四种低温下处理内脏油,得到晶体质量-时间曲线如图2所示。图2中,内脏油在不同温度下结晶4 h后的晶体质量几乎都达到平衡,平衡时晶体质量随着温度降低而上升。四条曲线的决定系数均大于0.97,对于质量-时间的关系拟合度非常高,可以准确的反映同一温度下结晶时间对晶体质量变化的影响,预测晶体的质量和得率。

图2 不同温度下晶体质量-时间曲线

2.4.2.2 不同温度下晶体中棕榈酸含量 不同温度下结晶1、2、3、4和24 h后晶体中棕榈酸的检测结果如表4。由表4看出,同一温度下,随着时间增加,棕榈酸含量呈现先上升后下降的趋势。结晶时间不足时,SFA和不饱和脂肪酸分离不完全,这时晶体中棕榈酸含量随着时间增加而上升。当棕榈酸的析出达到平衡点时,继续结晶会使大量的不饱和脂肪酸析出,从而导致晶体中棕榈酸含量发生下降[24]。

表4 不同温度晶体中棕榈酸含量(%)

同一时间内(24 h除外)晶体中棕榈酸含量随着温度的降低而下降,差异显著(P<0.05)。可能是温度过低时,大量不饱和脂肪酸也更迅速地析出,导致了同一时间内晶体中不饱和脂肪酸的含量更高,相应的棕榈酸含量更低[25]。

2.4.2.3 不同温度下棕榈酸质量-时间模型方程 利用不同温度下棕榈酸含量和晶体质量预测棕榈酸的质量,再拟合得到晶体中棕榈酸质量的传质模型方程,如表5所示。方程的决定系数R2>0.94,对棕榈酸质量-时间关系拟合度较好,可以较为准确地预测晶体中棕榈酸的质量和得率。再结合2.4.2.1晶体传质模型方程可以得到恒定温度下棕榈酸含量(m)-时间(t)模拟方程。

表5 不同温度下棕榈酸质量-时间模型方程

由表4棕榈酸含量变化趋势看出,棕榈酸含量的最大值通常在结晶1～4 h内出现,因此在1～4 h之间每隔0.1 h取点,利用MATLAB工具,描绘表5中各方程的图像,求解棕榈酸含量模拟的最大峰值,也就得到棕榈酸富集的最适温度和时间,最后通过试验验证。结果如表6所示。

表6 棕榈酸含量的模拟值和实际值(%)

-60和-80 ℃下棕榈酸含量模拟值低于40%,均没有达到富集目的。在表6中,-20 ℃时棕榈酸含量的最大模拟值为47.47%,-40 ℃时最大值为44.28%。通过实验验证,-20 ℃下结晶2.3 h时晶体中棕榈酸含量达到47.25%±1.67%,-40 ℃下结晶2.6 h后棕榈酸含量富集至42.62%±2.67%,两者间无显著性差异(P<0.05),并都与模拟值近似。

但-20 ℃时晶体中棕榈酸得率仅53.27%±2.86%,相对棕榈酸含量为47.72%±2.88%,比原料鱼油低;而-40 ℃时棕榈酸得率80.50%±4.39%,大部分棕榈酸被富集。此时sn-2棕榈酸含量68.19%±1.47%,显著高于原料鱼油和-20 ℃的晶体(P<0.05);相对棕榈酸含量为53.02%±3.06%,也比原料鱼油高,最接近人乳,适合作为配方奶粉中功能性棕榈酸的油脂来源。

综合考虑,小黄鱼内脏油中棕榈酸富集的最佳工艺条件为:油液比1∶6、温度-40 ℃、时间2.6 h,此时棕榈酸得率80.50%±4.39%;棕榈酸含量富集至42.62%±2.67%,比鱼油原料提高了61.01%;sn-2棕榈酸含量富集至68.19%±1.47%,比鱼油原料提高了70.73%,棕榈酸得到了很好的富集。

3 结论

不同提取方法对小黄鱼内脏油的理化性质和脂肪酸组成、分布有着显著影响。其中稀碱水解法的提取率最高,提取的内脏油理化性质最佳,而且PUFA、ARA、DHA含量和sn-2棕榈酸、相对棕榈酸含量均要高于酶解法和微波辅助法,更适合应用于婴幼儿配方乳粉市场。通过低温结晶传质模型确定小黄鱼内脏油棕榈酸富集的最佳工艺条件为:油液比1∶6、温度-40 ℃、时间2.6 h,此时棕榈酸得率80.50%±4.39%,油样中棕榈酸含量42.62%±2.67%,比鱼油原料有了明显的提高。模型对棕榈酸富集工艺条件的模拟效果很好,可以应用到其他脂肪酸的富集工艺中。虽然小黄鱼内脏油是改善婴儿配方奶粉中棕榈酸问题的潜在资源,但是富集的棕榈酸甘油酯仍存在腥味问题,如何解决还需进一步研究。