快速提取和分析马齿苋中五个三萜类化合物

盛同玲，李亚楠，李建鑫，胡 钰，陶 霞，陈立江，梁 啸

(辽宁大学 药学院，沈阳 110036)

马齿苋(PortLacaoleraceaL.)，又名马齿菜、五行草、蚂蚱菜，是马齿苋科马齿苋属植物全草[1].既可入药，又可食用，是我国卫生部划定87种药食同源的野生植物之一.马齿苋为一年生草本，全株无毛.茎平卧或斜倚，伏地铺散，多分枝，圆柱形，长10～15 cm淡绿色或带暗红色.马齿苋以其干燥地上部分入药，性味酸寒，具有清热解毒，凉血止血之功效.清热解毒，散血消肿.治热痢脓血，热淋，血淋，带下，痈肿恶疮，丹毒，痕疬.用于湿热所致的腹泻、痢疾，常配黄连、木香.内服或捣汁外敷，治痈肿.亦用于便血、子宫出血，有止血作用[2].

三萜类化合物是马齿苋中的主要活性成分之一[1-3].之前的药理学文献指出马齿苋中的这些三萜类化合物具有抗炎、抗菌、抗肿瘤、抗糖尿病、降低血糖、保护肝脏、抗溃疡[4].因此，马齿苋中三萜类化合物的提取与检测对于了解马齿苋药效物质基础以及质量控制是必要的.目前，仅有一篇文献采用高效液相-质谱(UPLC-PDA)测定马齿苋中羽扇豆醇的含量[5]，然而,上述方法非常的耗时而且灵敏度和专属性较差，不适合在中药这种复杂系统测定多个三萜类化合物.超高效液相串联质谱技术作为一种最现代分离和检测的方法已经越来越被人们所关注.它具有较短的分析周期、较好的分离效能、更好的峰型、较低的溶剂消耗、极高的灵敏度及高通量等特点.此外，串联质谱(MS/MS)及多反应监测(MRM)技术由于其高选择性，已经被证明非常适合对分析物的检测.UPLC-MS/MS技术可以同时测定多种含量相对较低的三萜类化合物.

在传统的提取方法中，植物中三萜类化合物的提取通常采用热回流提取法(HRE)，浸入提取法 (IE)和超声波提取法 (USE)[6].然而，随着能源价格上涨和二氧化碳排放对环境的影响，人们拥有极大的兴趣开发新技术(用最小的溶剂量和更少的能量)用于天然产物的提取.最近，微波提取法(MWE)已经成为作为一种从植物中提取三萜类化合物的趋势[7-8].在我们的研究中，使用四种不同的提取方法来比较黄酮类化合物的提取率[9].

本文中一个MWE-UPLC-MS/MS方法被用于5个三萜类化合物的提取和定量，包括：熊果酸(1)，2α,19α-二羟基熊果酸(2)，3α,19α-二羟基熊果酸(3)，19α,14-二羟基熊果酸(4)，3-乙酰氧基油桐酸(5)，化合物1～5的结构如图1所示.该方法不仅可用于不同产地及不同采摘期的马齿苋，而且也可以应用于提取和测定其他复杂系统中的三萜类化合物[10].

图1 五个三萜化合物结构

1 实验仪器与药材

1.1 实验仪器

UPLC-MS系统(Waters公司)；UPLC-MS系统 (ESI离子源)(AB Sciex公司)；Analyst software (versions 1.5.1) (AB Sciex公司)；XP-205十万分之一分析天平、XP-204万分之一分析天平(METTLER TOLEDO公司)；HH-2 数字显示恒温水浴锅(常州国华仪器有限公司)；旋转蒸发仪R-210(瑞士BUCHI公司)；超声提取器(昆山超声仪器有限公司)；微波提取器(广州和竺生物科技有限公司)；XW-80 型涡旋混合器 (江苏海门市麒麟医用仪器厂)；Waters ACQUITY UPLC BEH C18 (100×2.1 mm, 1.7 μm)色谱柱、Waters ACQUITY ；UPLC HSS T3 (100×2.1 mm, 1.7 μm) 色谱柱、Waters ACQUITY UPLC BEH Shield RP18(100×2.1 mm, 1.7 μm) 色谱柱(Waters公司)；微孔滤膜0.22 μm(密理博公司)；微孔滤膜0.45μm (Agilent公司)；离心管15 mL/50 mL(coning公司)；容量瓶5 mL/10 mL/25mL/50mL/100mL(Brand公司)；移液器10 μL/20 μL/100 μL/200 μL/1 000 μL/5 000 μL (Eppendorf公司)；玻璃仪器(蜀牛).

1.2 实验材料

1.2.1 材料名称

用于提取的甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、二氯甲烷(天津化工公司)为分析级；超纯水(密理博公司)；用于分析的乙腈和甲酸(Fisher公司)为色谱级；用于分析的50%甲酸水、甲酸铵、乙酸、乙酸铵(Sigma-Aldrich公司)为色谱级.

1.2.2 对照品名称

熊果酸(1) 、2α,19α-二羟基熊果酸(2) 、3α,19α-二羟基熊果酸(3) 、19α,14-二羟基熊果酸(4) 、3-乙酰氧基油桐酸(5) 均为自制(质量分数大于98%).

1.3 药材

药材的收集来自于中国的不同区域(辽宁沈阳、吉林白城、黑龙江榆树、安徽芜湖、四川乐山、湖北宜昌、河北沧州)及不同采摘期(河北1-4分别采摘于3、6、8、11月份)，经沈阳药科大学中药学院生药教研室路金才教授鉴定为马齿苋(PortLacaoleraceaL.).

2 提取工艺及测定指标

2.1 提取工艺

取马齿苋地上部分1 g用于不同提取方法(热回流提取法、浸入提取法、超声波提取法和微波提取法)的考察.

2.1.1 热回流提取法

将1 g药材放于50 mL玻璃烧瓶中，加入10 mL甲醇，放入80 ℃的水浴中，回流提取2次，每次2h.

2.1.2 浸入提取法

将1 g药材放于50 mL锥形瓶中，加入10 mL甲醇，在室温下浸泡提取2次，每次2 h.

2.1.3 超声提取法

将1 g药材放于50 mL 锥形瓶中，加入10 mL甲醇，放入在60 ℃水浴中，在40 kHz的频率下超声提取2次，每次30 min.

2.1.4 微波提取法

将1 g药材放于50 mL密闭容器中，采用单因素实验考察优化提取条件(提取溶剂、提取温度、提取时间、固液比).

所有的提取物都被浓缩，干燥，之后用50%的乙腈水溶解、稀释、定容在50 mL的容量瓶中，溶液经0.22 μm 微孔滤膜过滤，可用于进样，进样3 μL[11-12].

2.2 测定指标

2.2.1 UPLC条件

色谱柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18(100×2.1 mm, 1.7 μm)

流动相：乙腈-0.05%甲酸水溶液(V/V)梯度洗脱

梯度洗脱：采用二元梯度洗脱系统，溶剂A(乙腈)-溶剂B(0.05%甲酸水溶液)，梯度程序见表1.

表1 梯度洗脱程序

柱温：30 ℃;流速：0.3 mL/min;进样量：3 μL

按照实验的要求收集了12批不同产地批次的药材.见表2.

2.2.2 MS条件

采用电喷雾离子源(ESI)在负离子模式下检测.

离子喷雾电压：-4.5 kV;涡轮喷射温度：550 ℃;喷雾器和辅助气体：氮气;雾化气体压力：50 psi;加热辅助气压力：50 psi;气帘气压力：30 psi;扫描方式：MRM;每个化合物的MRM离子对、优化了的去簇电压(DP)、碰撞能量(CE)及碰撞单元出口电压(CXP)详见表3.

表2 产地和质量

表3 桔梗中五种三萜的保留时间，MRM跃迁，去簇电位(DP)，碰撞能(CE)和碰撞细胞出口电位(CXP)

2.3 结果和讨论

2.3.1 提取方法的优化

为了获得满意的提取率，使用Anhui样品对四种不同溶剂提取方法进行了评估.通过5个三萜类化合物的提取率评估了热回流提取法、浸入提取法、超声提取法和微波提取法.结果表明采用微波提取法(提取：70 ℃，固液比：20 mL/g，提取时间10 min)的提取率显著高于其他方法，而且微波提取法还拥有更短的提取时间的优势.结果见图2. 因此，微波提取法被选择成为提取方法[13].

通过5个三萜类化合物的提取率评估了不同的提取溶剂(二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、甲醇、乙醇、30%乙醇水(V/V)、70%乙醇水(V/V)和水).结果表明甲醇是最有效的提取溶剂.结果见图3.

为了进一步的优化微波提取法，考察了提取温度(60、70、80 ℃)、固液比(20、30、40 mL/g)、提取时间(8、10、12 min)等参数[14].结果表明，微波提取法的最优条件为以甲醇作为提取溶剂，提取温度为70 ℃，提取时间为10 min，固液比为30 mL/g时，提取率最高.结果见图4.

图2 提取程序的评估：(A)提取方法的评估(MWE：甲醇，70 ℃，10 min，20 mL /g，其他提取方法参见“实验”)

图3 提取程序的评估：(B)不同溶剂的评估

图4 MWE程序的优化(萃取温度，溶剂与固体之比和萃取时间)

2.3.2 UPLC条件的优化

对不同种类的流动相进行了测试.与甲醇相比，乙腈所用分析时间较短及峰型更好.几个流动相添加剂,包括甲酸、冰醋酸、氨和醋酸铵,被用来优化分析物的分离度、峰型和质谱电离强度.最终，0.05%甲酸被选作为流动相添加剂,因为它能使分析物的离子强度更高和产生一个更好的分离效能.

三种色谱柱被考察，包括Waters ACQUITY UPLC BEH C18(100×2.1 mm, 1.7 μm)；Waters ACQUITY UPLC HSS T3 (100×2.1 mm, 1.7 μm)；Waters ACQUITY UPLC BEH Shield RP18(100×2.1 mm, 1.7 μm).最终选择Waters ACQUITY UPLC BEH C18(100×2.1 mm, 1.7 μm)作为分析色谱柱，因为三萜类化合物的同分异构体在该色谱柱上拥有最佳的分离度、更佳对称峰的形状,及更短的色谱分离时间.5个三萜类化合物的的总离子流图见图5.

图5 五个三萜的标准混合物的总离子色谱法

2.4 方法学考察

2.4.1 校正曲线

制备5个化合物的乙腈储备溶液，稀释至适当的质量浓度用以建立校正曲线，按上述色谱条件测定，记录色谱峰面积.以峰面积(y)对质量浓度(x)进行线性回归，结果表明该方法在实验质量浓度范围内线性关系良好.结果见表4.

2.4.2检测限(LOD)和定量限(LOQ)

稀释5个三萜类化合物的乙腈储备溶液成一系列适当的质量浓度，检测限和定量限测量的信噪比(S / N)分别大约为3和10.检测限和定量限均分别小于1.211和4.335 ng/mL, 说明该方法检测这5个三萜类化合物的具有较高的灵敏度[15].结果见表4.

2.4.3 精密度

精密度是通过日内精密度和日间精密度来评价的.采用用相对标准偏差(RSD)来作为精密度的衡量指标.选用样品Anhui作为提取和分析的对象，日内精密度是一天内重复进样6次，日间精密度是连续进样3 d.日内和日间精密度的相对标准偏差均分别低于2.56%和2.73%，说明该方法适合于定量测量这5个三萜类化合物.结果见表5.

2.4.4 准确度

准确度测试是通过回收率实验来实现的.准确称取九份0.5 g包含5个三萜类化合物的药材样品.9份样品分别加入三种不同质量浓度的标准(大约相当于0.5、1.0和1.5倍样品的质量浓度)，然后进行该样本提取，使用最佳样品提取过程如上所述.回收率通过测得量与加入量的比计算得到.所有分析物的整体回收率范围从95.1%到104.4%,且回收率的相对标准偏差均低于2.79%，这说明该方法可以准确的测定这些分析物的含量.结果见表5.

2.4.5 重现性

重现性是由分析Anhui样品得到的.三份样本，分别提取每个0.5 g,每份进样3次.重复性的结果显示相对标准偏差均低于2.84%.结果见表 5.

综上所述，该方法的验证结果显示良好的线性、灵敏度、精确度、重现性和准确度.

表4 五个马齿苋三萜的UPLC-ESI-MS / MS分析的校准参数

表5 UPLC-ESI-MS / MS分析马齿苋的五个三萜的精密度、准确性、可重复性和回收率

2.5 定量分析

在最优的条件下，同时检测十个不同批次马齿苋中含5个三萜类化合物的量.采用标准曲线法进行定量分析.不同批次马齿苋中含5个三萜类化合物的总量见图6.不同批次马齿苋中5个三萜类化合物的量见表5.定量结果表明化合物1和3在所有测试样品中含量较高.样品Anhui中化合物1、3及5的量高于其他样品，样品Heibei-4中化合物2在所有测试样品中最高.样品Liaoning中化合物4在所有测试样品中最高.我们的研究结果表明，不同生产区域的样品中5个三萜类化合物的差别很大.

图6 不同来源马齿苋中含五个三萜的总量(n=3，μg/ g)

3 结 语

本文开发的MWE-UPLC-MS/MS方法只需要10 min就可以提取马齿苋中的5个三萜类化合物，在11 min内就可对这些三萜类化合物进行定量分析.此外该方法也可大量减少溶剂消耗.验证数据表明，微波提取法结合UPLC-MS/MS技术是十分可靠和稳定的.这些药物活性成分的测定为马齿苋质量评估及临床应用提供了很有价值的信息.

表6 来自不同来源的西洋参中含五个三萜的量(n=3，μg/ g)