黑豆皮花青素的提取及体外抗菌活性研究

苏 适，李 月，董立强，马 瑞

(绥化学院 食品与制药工程学院，黑龙江 绥化 152061)

黑豆(Glycinemax(L.)merr)为豆科植物大豆的黑色种子，属一年生草本植物，其中富含脂肪、多糖、蛋白质、纤维素、维生素、氨基酸和微量元素等营养成分[1].根据中医理论，黑豆具有乌发养血、补肾益精、明目镇心、消肿解毒等功效.黑豆种皮中富含的花青素是一种类黄酮化合物，具有抗氧化、抗肿瘤、减轻肝功能障碍、美容养颜和改善视力等作用[2-5].原花青素的抗菌、抗病毒作用的研究表明一定浓度的原花青素溶液对多种细菌均有抑制作用[6].随着黑豆的营养价值逐渐被人们所认识，作为一种食药两用型的健康食品，黑豆的种植范围和产量也逐年扩大.

花青素的提取方法有超声法、有机溶剂浸提法和微波法等.传统提取和分离方法有污染重、能耗高、试剂回收率低等问题.微波辐射提取技术利用电磁场的作用使样品中的某些有机物成分与基体有效的分离,且提取效率高[7]，已经成为研究的热点.离子液体在室温下呈液态，由有机阳离子和无机阴离子构成，具有溶解性好、极性强、可设计性和循环使用等特殊优点，是一种绿色的有机溶剂[8-10].本文采用微波辅助离子液体提取黑豆皮花青素，利用正交试验优化提取工艺，同时对花青素的抑菌能力进行研究，为黑豆的进一步开发提供理论依据.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

材料：黑豆，购自永辉超市.原花青素标准品(质量分数 98 %)：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；染料木素标准品(质量分数 98 %)：中国药品生物制品检定所；1-丁基-3-甲基咪唑氯盐(质量分数 97 %)：阿尔法试剂有限公司；琼脂粉、蛋白胨、牛肉膏、硝酸铝、氯化钠、氢氧化钠、亚硝酸钠(均为分析纯)：国药试剂有限公司.

供试菌种：供试菌种均为绥化学院微生物实验室提供.

1.2 试验仪器

PZ-TQ-Q微波提取器：上海斡龙微波科技有限公司；101C-2B电热鼓风干燥箱：上海市实验仪器总厂；XV-9200紫外分光光度计：北京市精密仪器厂；HB-III水循环多用真空泵，郑州长城科工贸有限公司；SPX-150B-2生化培养箱：海博迅实业有限公司医疗设备厂；JD-CJ-1A型超净工作台：苏州金大净化工程设备有限公司.

1.3 实验方法

1.3.1 样品预处理

将黑豆人工去皮，置于 40 ℃燥箱中干燥至恒重，粉碎后过 60 目筛，备用.

1.3.2 标准曲线绘制

参考文献[3]采用盐酸-香草醛法测定花青素质量浓度，花青素能与显色剂反应，在 500 nm 处有最大的吸收峰.称取10 mg原花青素标准品，配成0.1 mg/mL的标准品溶液.分别移取0.1、0.3、0.5、0.7、0.9 mL标准品溶液置于10 mL的容量瓶中，加入5.00 mL 显色剂，用1%的盐酸甲醇溶液定容，恒温水浴 30 min，花青素在530 nm波长处有最大吸收峰，在此波长下测出待测溶液的吸光度值.以花青素质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐，得标准曲线为Y=0.9620X+0.0067，R2=0.9964.

1.3.3 提取率计算

称取1.0 g黑豆皮粉末，以离子液体为提取剂，在一定实验条件下提取花青素，提取液以3 000 r/min，离心40 min，取得上层清液，按1.3.1项下方法测定其吸光度，并根据回归方程，计算黑豆花青素质量浓度及提取率：

其中：C为花青素质量浓度(μg/mL)；V为定容体积(mL)；n为稀释倍数；M为原料质量(g).

1.3.4 微波辅助离子液体提取花青素及纯化

称取黑豆皮粉末1.0 g，采用离子液体水溶液为溶剂，料液比为 1∶20，微波功率 500 W，温度 60 ℃，提取 6 min；加入 2 倍体积的无水乙醇，沉淀去除粗提取液中的蛋白质、多糖等杂质，2 000 r/min，离心 10 min，取上清液再用石油醚、氯仿依次萃取，除去粗提取液中的脂溶性成分，弃掉有机层.合并离心后的上清液；对分离纯化后的提取液用旋转蒸发仪在 40 ℃水浴中蒸发浓缩至 10 mL，装入容量瓶中，4 ℃保存，备用.

1.4 微波辅助离子液体提取法单因素实验设计

离子液体浓度: 固定提取温度50 ℃，微波功率300 W，料液比 1∶15 g/mL，提取6 min，考察不同离子液体浓度(0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mol/L)对花青素提取率的影响.

微波功率: 固定提取温度为 50 ℃，料液比15 g/mL，离子液体浓度0.8 mol/L，提取 6 min，考察不同微波功率(100、200、300、400、500 、600 W) 对花青素提取率的影响.

料液比: 固定提取温度 50 ℃，微波功率300 W，离子液体浓度0.8 mol/L，提取6 min，考察不同料液比(1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30) 对花青素提取率的影响.

提取时间: 固定提取温度50 ℃，微波功率300 W，离子液体浓度0.8 mol/L，料液比 15 g/mL，考察不同提取时间(3、4、5、6、7、8 min) 对花青素提取率的影响.

1.5 正交试验设计

在单因素试验的基础上，选取离子液体浓度(A) 、微波功率(B) 、料液比(C)、提取时间(D) 进行四个因素三水平正交试验，如表1所示.

表1 正交试验因素水平表

1.6 花青素的抑菌圈实验

试验采用大肠杆菌、短小芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌作为供试菌；采用滤纸片法[10]判断花青素的抑菌活性.将黑豆皮花青素提取液稀释至0.0、0. 05、0.25、0.35、0.45、0.55 mg·mL-1作为供试样品溶液.在超净台上分别将菌种活化，并用无菌涂布棒涂布均匀到牛肉膏蛋白胨培养基平板上，在平板上分别放置浸有不同浓度样品溶液的 6 mm 滤纸片，放生化培养箱内 37 ℃培养 24 h，观察抑菌效果，用游标卡尺测定抑菌圈的直径，另选取一个只加以无菌水为对照组，抑菌圈直径越大则抑菌活性越强[11-12].

2 结果与分析

2.1 不同提取方法对提取率的影响

提取黑豆皮花青素提取率高低依次是微波辅助离子液体法>传统有机溶剂法.

2.1.1 离子液体浓度对提取率的影响

由图1可知，随着离子液体浓度的增加，花青素的提取率随之升高，在离子液体浓度试验设定范围内，花青素的提取率也随着 [BMIM]Cl浓度的增加而增大.当[BMIM]Cl的浓度达到 1.0 mol/L 时，花青素提取率达最大，当离子液体的浓度超过 1.0 mol/L时，提取率开始下降.可能是花青素类化合物是一类极性化合物，在离子液体浓度为1.0 mol/L溶液中溶出程度最大[13].所以，离子液体浓度选择1.0 mol/L 最佳.

图1 离子液体浓度对提取率的影响

2.1.2 微波功率对提取率的影响

由图2可知，微波功率在100～500 W的试验设定范围内，随着微波功率的升高，黑豆皮花青素的提取率逐渐升高，当功率为500 W时，花青素的提取率最高，随后提取率开始下降.微波功率越大，使得体系温度上升迅速，花青素的浸出量逐渐增加；而功率过大时，系统内的强热导致花青素被氧化[14]，故提取率下降.所以，最佳的微波功率选为 400 W.

图2 微波功率对提取率的影响

2.1.3 料液比对提取率的影响

由图3可知，料液比在1∶5～1∶25的试验设定范围内，花青素提取率随着料液比的增大而升高，料液比为1∶25时，提取率达到最大值，当料液比高于1∶25时，花青素提取率开始下降.可能是体系中所能提取的花青素达到溶解极限，溶剂量增加也不能再提高花青素提取率，反而会增加杂质成分的溶出[15]，影响后序浓缩工艺，加大成本.所以，选择料液比为 1∶15.

图3 料液比对提取率的影响

2.1.4 提取时间对提取率的影响

由图4可知，提取时间在3～7 min的试验设定范围内，花青素提取率随着时间的延长而升高，微波提取时间在7 min时，提取率达到最大值，随后没有明显增加.可能是花青素溶出量达到饱和，继续延长提取时间花青素也不再继续溶出[16].所以，综合考虑成本因素，超声时间选择7 min.

图4 提取时间提取率的影响

2.2 提取工艺优化

根据正交试验分析的结果，各因素对黑豆皮花青素取效果影响的主次顺序依次为 A>C>D>B.由表 2 极差分析可知，花青素提取得率最高的理论组合应为A1B3C3D1，即离子液体浓度0.8 mol/L、微波功率500 W、料液比 1∶25(g/mL)、提取时间5 min，此条件下多酚提取得率为4.45 %.

2.3 抑菌活性研究

本试验测定了不同质量浓度黑豆花青素的抑菌活性，结果如表3所示.由表3可知，花青素质量浓度低于0.25 mg/mL时，对五种菌株的生长均无抑制作用；质量浓度在0.5～1.75 mg/mL对金黄色葡萄球菌的生长有较明显的抑制作用；质量浓度在0.75～1.75 mg/mL对短小芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌的生长有较明显的抑制作用.在一定质量浓度范围内，花青素的抑菌作用随着质量浓度的升高而增强.

由表3可知，用最佳工艺条件下制得的黑豆皮花青素对受试三个菌种均有抑制作用，最小抑菌质量浓度均为 0.20 mg/mL，按敏感程度顺序依次为: 枯草芽孢杆菌，金黄色葡萄球菌，大肠杆菌.

表2 正交试验结果表

表3 黑豆花青素的最低抑菌质量浓度实验结果

3 结 语

黑豆皮中花青素含量丰富，本研究采用微波辅助离子液体提取法，正交试验优化得到最佳工艺条件为：离子液体浓度1.0 mol/L、微波功率400 W、料液比 1∶20(g/mL)、提取时间5 min，此条件下黑豆花青素的提取率可达4.45%，离子液体可重复利用，是一种高效提取黑豆花青素的方法.抗生素的广泛使用导致耐药菌株越来越多，本试验采用滤纸片法确定黑豆皮花青素的抑菌活性，花青素对细菌的生长具有良好的抑制作用，后续可对其抑菌机制等进行研究，本研究对更好地为天然抗菌抑菌剂的研发提供理论依据，更为黑豆皮的综合利用开辟新路.