温肺化纤汤干预肺纤维化大鼠肺组织中Nrf2含量研究

2020-10-29 06:16李少峰魏兴洪兰智慧张元兵
亚太传统医药 2020年10期
关键词:温肺化纤肺纤维化

李少峰,魏兴洪,高 洁,兰智慧,张元兵

(1.江西中医药大学附属医院,江西 南昌 330006;2.赣州市南康区第二人民医院,江西 赣州 341411;3.南昌市洪都中医院,江西 南昌330006)

肺纤维化(Pulmonary fibrosis,PF)是指因各种原因引发的弥漫性肺部炎性疾患,病变多累及肺间质、肺泡上皮细胞及肺血管,在我国发病率呈逐渐上升态势。肺纤维化是一个进行性、破坏性、基本不可逆的疾病,目前的治疗手段效果甚微,确诊后平均存活期为2~5年[1-2]。因此,明确肺纤维化发病机制迫在眉睫,近年来国内外专家提出氧化/抗氧化失衡引起的氧化应激反应是其发病重要机制之一[3],Nrf2/ARE信号通路可调控抗氧化蛋白及Ⅱ相解毒酶的表达,通过抗氧化而发挥对机体的保护作用,其作为体内重要抗氧化调节通路,已成为多学科研究热点。

温肺化纤汤是江西省名中医刘良徛教授治疗PF临床经验方,该方传承于国医大师洪广祥教授“治肺不远温”学术思想,团队经过多年临床验证,临床疗效确切,已获得国家发明专利(专利号:ZL201210365678.0),并由我们牵头制定《肺痿诊疗专家共识意见(江西省)》[4]。温肺化纤汤方由《外科证治全生集》的阳和汤化裁而来,具有温阳化痰、活血化瘀的作用,前期药理实验表明,温肺化纤汤具有一定的体外抗氧化活性[4-9],但具体机制不明确,本研究从抗氧化应激角度探讨温肺化纤汤的作用机制,阐明其作用靶点,为防治肺纤维化提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SD雄性大鼠,SPF级,体重180 g。

1.2 药物

温肺化纤汤组成:熟地20 g,肉桂4 g,鹿角霜15 g,麻黄10 g,白芥子10 g,炮姜10 g,桃仁10 g,土鳖虫10 g,红花10 g,川芎10 g,地龙10 g。按药物剂量比例制成温肺化纤汤投料处方,通过醇提取、挥发油提取及水提取等工艺流程,萃取、提纯药物成分,浓缩、干燥后制成温肺化纤汤颗粒剂。该药由广东一方制药有限公司制备和提供。

1.3 试剂及仪器

硫酸博来霉素(MB1039)。胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)比色法测试盒,总超氧化物歧化酶(SOD)比色法测试盒,过氧化氢酶(CAT)比色法测试盒。RNAiso Plus(TaKaRa,9109)、GAPDH、NRF2引物均由福州尚亚生物科技有限公司合成,RIPA强裂解液(凯基,KGP702),SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5X)(碧云天,P0015L),封闭液(碧云天,P0023B),普通PCR仪、蛋白垂直电泳仪、化学发光成像系统、小型垂直电泳槽、酶标仪(美国BIO-BAD公司),荧光定量PCR仪(美国ABI,7300)。

1.4 分组给药

适应性喂养大鼠1周后,用随机数字表法分成模型组和正常组,温肺化纤汤低、中、高剂量组,每组3只。参考文献[7]造模方法,建造肺纤维化大鼠模型,即正常组大鼠予以基础饲料,同时,各组灌服相应剂量的温肺化纤汤颗粒或饮用水,治疗4周。参考文献[7]相关资料的干预剂量,温肺化纤汤高剂量组为5倍临床剂量,0.9 g药物颗粒,温肺化纤汤中剂量组为3倍临床剂量,0.54 g药物颗粒,温肺化纤汤低剂量组为临床等效剂量,0.18 g药物颗粒,建模后第2日起进行3次灌胃,每次3 mL温肺化纤汤灌胃。

1.5 标本采集

造模28天后进行取材,麻醉大鼠后取肺脏组织。样品分成4份。一份左肺,用4%多聚甲醛固定液固定,常温保存;右肺分成3份,保存于-80 ℃冰箱。

1.6 病理学观察

挑选3块新鲜肺组织样本,每块大小约1 cm×1 cm×1 cm,将肺组织样本用固定液固定在冰冻切片机上,时长为15 min,切为10 μm左右厚度的切片,用光镜观察常规油红HE染色后的脂滴分布状况。

1.7 Nrf2mRNA

应用实时荧光定量PCR的方法测定,总RNA提取试剂盒提取肺组织RNA,逆转录试剂盒合成cDNA,全自动荧光定量PCR仪增大并测定荧光。Nrf2引物序列:上游F:CCTCTGCTGCCATTAGTCAGT,下游:R:CTTCAGTGTGCTTCTGGTTGA,GAPDH引物序列:上游:F:GACTCCACTCACGGCAAAT,下游:R:GACTCCACGACATACTCAGCA,反应条件为95 ℃预变性1 min后95 ℃变性20 s,而后56 ℃退火30 s,再72 ℃延伸30 s,最后循环40次。用比较Ct的方法测算mRNA相对表达倍数。

1.8 Western Blotting法测定Nrf2蛋白表达

将100 mg左右的肺组织放入含1 mmoL·L-1·kg-1PMSF的500 μL RIPA裂解液,研磨组织,充分裂解,配平后于4 ℃,12 000 r·minkg-1离心20 min,取上清液低温待用,并测定蛋白含量。样本通过SDS-PAGE电泳后分离出蛋白,转移PVDF膜上,从电转槽中取出膜,漂洗TBS,置于封闭液中室温摇荡2 h;转膜,加一抗稀释液4 ℃摇床,洗膜,加入二抗稀释液,于4 ℃室温下孵育1 h,洗涤后于暗室在X光片上显影,ECL显色剂按A∶B =1∶1的比例现配现用,注意避光,用化学发光仪显影拍照。将显影后的数据用image lab分析。

1.9 统计学方法

2 结果

2.1 大鼠一般情况观察

正常组大鼠形体正常,精神状态好,活动自如。模型组大鼠形体肥胖,精神倦怠,动作迟缓,体毛枯黄易脱落,进食、饮水量大,大便质软,垫料湿度大。温肺化纤汤高、低剂量组大鼠的精神、形体、活动、毛发、饮水、进食、排泄物均更佳,以温肺化纤汤高剂量组的改善情况最为明显。

2.2 大鼠肺组织病理变化

正常组大鼠肺细胞核为蓝色,细胞内未有显著的橘红色脂滴,间隙清晰,肺窦正常。模型组大鼠细胞明显肿大,出现弥漫性红染脂滴,相邻肺细胞内脂滴融合,细胞核多被挤压于一侧。温肺化纤汤高、低剂量组橘红色脂滴少于模型组,其中以温肺化纤汤高剂量组改善较显著(见图1)。

注:A.对照组;B.模型组;C.低剂量处理组;D.中剂量处理组;E.高剂量处理组。

2.3 大鼠肺组织Nrf2水平比较

通过Western Blotting法对肺纤维化大鼠肺组Nrf2表达水平进行检测,进一步明确温肺化纤汤增强抗氧化能力的机制。结果表明,与对照组比较,肺纤维化、中、高剂量温肺化纤汤处理组胞核Nrf2表达水平增加(P<0.05)。与模型组相比,高剂量处理组温肺化纤汤胞核Nrf2表达水平增加,差异有统计学意义(P<0.01)。与低剂量温肺化纤汤处理组比较,中、高剂量温肺化纤汤处理组上述指标明显改善(P<0.05)。中、高剂量温肺化纤汤处理组间比较无统计学意义(P>0.05)(见图2、图3)。

3 讨论

研究认为,氧化与抗氧化失衡同肺纤维化的发病息息相关,在该病的病理演变中起着十分重要的作用[3]。目前,中医药在PF领域主要通过调节细胞因子、抑制细胞外基质合成、调节氧化应激系统来防治,是一个多方位的过程[10]。江西省名中医刘良徛教授认为PF是一个本虚标实之证,阳虚是本病的内因,阳虚证候可出现在肺纤维化病情发生发展过程中,痰和瘀是本病的继发因素,阳虚、痰浊、血瘀构成了PF的3个主要环节[11-12]。基于全程温肺理论,刘教授创制了具有温阳散寒、化痰行瘀之功的温肺化纤汤治疗PF,疗效较好。前期实验结果显示,温肺化纤汤具有一定的抗氧化活性,可改善博来霉素致大鼠肺纤维化模型的肺组织损害,纤维组织增生减少[13-14],纤维化评分降低,这些都提示抗氧化是温肺化纤汤治疗肺间质纤维化的有效途径。

注:1.对照组;2.模型组;3.低剂量处理组;4.中剂量处理组;5.高剂量处理组;采用实时荧光定量PCR(qRT- PCR)法测定肺组织Nrf2mRNA的表达,*为与模型组、对照组、低剂量组比较,P<0.05;**为与模型组、对照组、低剂量组比较,P<0.05。

Nrf2是调控氧化应激最具代表的核转录因子。生理情况下,细胞质中的Nrf2与Keap1偶联后以失活状态固定于胞质内,泛素化后由26 S蛋白酶体所降解,当遭受氧化剂刺激后,Keap1被氧化发生构象改变,随后与Nrf2解偶联,Nrf2释放后转位入胞核内,与抗氧化反应元件结合,诱导下游SOD、CAT、GSH等抗氧化酶基因的转录,从而调控细胞内抗氧化酶表达[15]。

本研究主要检测了肺组织中Nrf2的含量。与对照组比较,肺纤维化组、中、高剂量温肺化纤汤处理组胞核Nrf2表达水平增加(P<0.05),差异具有统计学意义,即空白组大鼠肺组织中Nrf2含量最低,提示博莱霉素致大鼠肺纤维化模型造模基本成功。与模型组相比,高剂量处理组温肺化纤汤Nrf2表达水平增加,差异有统计学意义(P<0.01),说明应用高剂量后实验大鼠肺组织中的Nrf2指标变化明显。与低剂量温肺化纤汤处理组比较,中、高剂量温肺化纤汤处理组上述指标明显改善(P<0.05),说明中、高剂量是有效药物浓度。然而,中、高剂量温肺化纤汤处理组间比较差异不明显(P>0.05),换言之,应用中、高剂量后实验大鼠肺组织中的Nrf2指标变化不明显。

图3 GAPDH、Nrf2溶解曲线

综上,温肺化纤汤可能通过增加Nrf2蛋白,干预实验性肺纤维化,但本实验相对简单,仅探讨了在肺纤维化形成过程中Nrf2表达的作用,而具体的作用机制、是否有其他通路的作用等方面还需进一步深入研究。

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