剑麻酵母双杂交cDNA表达文库的构建及与AhKNOX2相互作用蛋白的筛选

杨子平 孙艺桓 杨倩 鹿志伟 张燕梅 李俊峰 周文钊

摘  要：植物KNOX（Knotted1-like homeobox）可通过蛋白质相互作用参与调控落果、纤维细胞发育、次生细胞壁发育、开花等事件。为筛选剑麻叶中与AhKNOX2相互作用的蛋白，采用SMART同源重组技术构建剑麻叶片酵母双杂交表达文库，利用AhKNOX2为诱饵筛选与之相互作用的蛋白。结果表明：文库总容量为3.9106 CFU，转化效率为9.15105 CFU/μg pGADT7-Rec，插入片段大小主要分布于0.5～3.0 kb之间，重组率为92%，保存的文库细胞密度为1.35108/mL，文库滴度为2.22107 CFU/mL。构建的pGBKT7-AhKNOX2诱饵载体存在自激活性，5 mmol/L的3-氨基- 1，2，4-三唑（3-Amino-1，2，4-triazole，3-AT）能抑制诱饵载体的自激活，通过筛选获得了16个与AhKNOX2相互作用的蛋白。本研究成功构建剑麻叶片酵母表达文库，并筛选获得与AhKNOX2相互作用的蛋白，该结果为进一步研究AhKNOX2在剑麻中的功能奠定前期基础，为培育高纤维产量的剑麻新品种提供基因资源和理论基础。

关键词：剑麻;AhKNOX2;酵母双杂交;cDNA文库;蛋白质相互作用

中图分类号：S563.8;Q78      文献标识码：A

Abstract： To obtain the proteins interacting with AhKNOX2 in Agave hybrid No.11648， a full length-expression cDNA library was constructed in yeast strain Y187 using homologous recombination-mediated SMART technology. The capacity of the cDNA library was 3.9×106 CFU and the transformation efficiency was about 9.15×105 CFU/μg pGADT7-Rec. The PCR amplification of 24 clones randomly selected from the cDNA library indicated that the length of most inserts was ranged from 0.5 kb to 3.0 kb， with a recombination rate of 92%. The cell density was 1.35×108/mL and the titer was up to 2.22×107 CFU/mL. The bait vector （pGBKT7-AhKNOX2） was transformed into yeast strain Y2HGold， colonies appeared on SD/-Trp/-His media and was inhibited by 5 mmol/L 3-AT. After screening the library using bait plasmids，a total of 16 proteins interacting with AhKNOX2 were obtained by sequencing and homology analysis. In conclusion， a high-quality cDNA library was constructed and 16 proteins interacting with AhKNOX2 were screened from cDNA library.

Keywords： Agave hybrid; AhKNOX2; yeast two-hybrid; cDNA library; protein-protein interaction

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.09.004

同源异型盒基因（homeobox genes）广泛存在于真核生物中，编码一类含有保守同源异型盒结构域（homeodomain，HD）的转录因子，在生物个体形态建成、生殖发育、细胞命运、非生物胁迫等生命活动中发挥着重要的调控作用[1-6]。KNOX亞家族几乎存在于所有植物中，其编码蛋白N端至C端依次存在MEINOX、GSE、ELK、HD 4个保守结构域，MEINOX（包含KNOX1和KNOX2结构域）和ELK结构域与蛋白质间的相互作用有关，核定位信号位于ELK结构域，GSE结构域涉及泛素降解途径调节蛋白的稳定性，HD位于蛋白的C端[7]。由于在植物中的表达模式和基因中内含子位置存在差异，KNOX亚家族被进一步分为ClassⅠ和ClassⅡ 2大亚家族[8]。ClassⅠ类亚家族主要在分生组织中表达，是分生组织发生与维持所必需的关键转录基因，参与侧生器官的形态建成[9-10]、调控激素[11-12]和木质素合成[13-14];ClassⅡ类亚家族在所有植物组织均有表达，目前发现调控植物次生细胞壁形成和纤维的发育[15-17]。

现有研究发现KNOX成员可通过蛋白质相互作用，形成复合物调控植物细胞壁的形成、木质素的合成、细胞壁的扩张和加固[18-21]。Abraham- Juárez等[22]首次报道了剑麻中2个Ⅰ类KNOX基因。接着Zhou等[23]研究发现一个Ⅰ类KNOX基因在茎尖分生组织和幼龄的叶片中高表达。Gross等[24]的研究结果则表明剑麻Ⅰ类KNOX基因在叶片基部表达，在叶片中上部不表达。剑麻KNOX2调控珠芽的发育，在珠芽发育的起始阶段，剑麻KNOX2随着珠芽的增大，表达量逐渐增加;在拟南芥中过表达剑麻KNOX2，导致叶出现裂片的表型;进一步发现剑麻KNOX2能够回补拟南芥knat1突变表型[22]。植物KNOX基因参与叶片的形态建成和纤维的发育，初步推测剑麻KNOX2基因参与调控剑麻叶片和纤维的发育。因此，本课题组克隆了国内主栽品种H.11648（Agave hybrid No.11648）的AhKNOX2基因，构建剑麻叶片酵母双杂交cDNA表达文库，筛选与AhKNOX2相互作用的蛋白，从蛋白质相互作用的角度研究AhKNOX2基因在剑麻叶片中的功能和调控网络，结果为培育高纤维产量的剑麻新品种提供基因资源和理论基础。

1  材料与方法

1.1  材料

剑麻H.11648采自中国热带农业科学院南亚热带作物研究所剑麻种质保存圃;RNA提取试剂盒购自北京华越洋生物科技有限公司;反转录试剂盒、Hi-Fusion试剂盒、Nde I和BamH I购自江苏愚公生命科技有限公司;双链cDNA纯化、酵母转化和文库构建试剂盒购自Clontech公司;用于配制酵母培养基的试剂和其他试剂购自Sigma- Aldrich公司。

1.2  方法

1.2.1  总RNA的提取  采集H.11648品种5龄植株叶样品，液氮速冻。将样品研磨成粉，按照华越洋多糖多酚RNA提取试剂盒操作，取50～100 mg样品提取其总RNA。

1.2.2  RNA的反转录  反转录按照愚公生物M- MLV GIII First-Strand Synthesis Kit操作。反应体系中加入1.0 μL CDS Ⅲ和1.0 μL SMART Ⅲ引物，以提取的总RNA为模板，反转录获得带同源重组接头的单链cDNA。反转录程序为：55 ℃30 min;85 ℃ 1 min。CDS Ⅲ和1.0 μL SMART Ⅲ引物序列见表1。

1.2.3  双链cDNA的合成  以反转录的单链cDNA为模板，加入5 PCR引物和3 PCR引物（表1），利用Advantage 2 Polymerase Mix合成双链cDNA。PCR扩增条件为：95 ℃ 30 s;95 ℃ 10 s，68 ℃ 6 min，68 ℃ 5 min，26个循环。

1.2.4  双链cDNA的纯化  预先将CHROMA SPINTM TE-400纯化柱中胶体和缓冲液混合均匀，瞬时离心弃液体。将93 μL双链cDNA加入纯化柱胶体，700?g离心5 min。向收集液中加入2.5倍體积无水乙醇和1/10体积的3 mol/L乙酸钠，置于20 ℃沉淀DNA。用20 μL无菌水溶解沉淀物，并测定双链cDNA浓度。

1.2.5  文库构建  按照YeastmakerTM Yeast Trans-formation System 2操作制备酵母感受态细胞。取纯化的双链cDNA（2～5 μg）与3 μg线性化pGADT7-Rec质粒共转化Y187酵母菌，转化菌体用6 mL生理盐水悬浮，每个平板100 μL，将悬浮液涂布于不含亮氨酸的综合培养基（SD/-Leu）平板上，于30 ℃培养5 d。将培养平板于4 ℃放置 4 h，向平板加入5 mL液体酵母膏胨葡萄糖琼脂培养基（YPDA）（含25%的甘油），用涂布棒刮离酵母菌，收集菌体悬浮液。浓缩文库体积，血球板计数法计算细胞密度，使文库细胞密度大于2×107/mL。按每管1 mL，将浓缩液分装于1.5 mL无菌管中，保存于80 ℃。

1.2.6  文库质量检测  取100 μL悬浮液用生理盐水逐步稀释10倍和100倍，取100 μL稀释液涂布SD/-Leu平板，30 ℃培养5 d。采用ImageJ软件统计生长菌落数。按照如下公式分别计算文库容量和转化效率：

挑取SD/-Leu平板上的菌落，利用pGADT7- Rec的载体引物PCR鉴定插入片段。PCR扩增条件为：95 ℃ 10 min;95 ℃ 45 s，58 ℃ 45 s，72 ℃ 3 min，55 个循环;72 ℃ 5 min。用1%琼脂糖凝胶电泳检测。按照如下公式计算重组率：

取10 μL文库保存液悬浮于1 mL YPDA液体培养基中，混合均匀得稀释液A（稀释度102）。从稀释液A中吸取10 μL悬浮液加入1 mL YPDA液体培养基中，混合均匀得稀释液B（稀释度104）。分别从稀释液A和稀释液B中取10 μL和50 μL悬浮液涂布于SD/-Leu平板，30 ℃培养5 d。采用ImageJ软件统计生长菌落数。按照如下公式计算文库滴度：

1.2.7  诱饵载体构建  设计携带Nde I和BamH I酶切位点的特异引物（表1），扩增AhKNOX2编码框。将AhKNOX2编码框插入pGBKT7载体，构建诱饵载体。诱饵载体双酶切检测并送测序。

1.2.8  诱饵载体自激活检测及3-氨基-1，2，4-三唑（3-AT）抑制浓度筛选  将pGBKT7-AhKNOX2载体转化Y2HGold酵母菌株，转化液分别涂布于不含色氨酸的综合培养基（SD/-Trp）、SD/-Leu、不含色氨酸和腺嘌呤的综合培养基（SD/-Trp/-Ade）和不含色氨酸和组氨酸的综合培养基（SD/-Trp/-His）平板，30 ℃培养5 d，以检测诱饵载体是否具有自激活性。将携带有诱饵载体的Y2HGold酵母菌株涂布于含不同浓度的3-AT的SD/-Trp/-His平板，30 ℃培养5 d，以确定3-AT的抑制浓度。

1.2.9  互作蛋白筛选  使用50 mL SD/-Trp液体培养基扩大含诱饵载体的Y2HGold酵母菌株，收集菌体与1 mL文库菌体混合于50 mL 2×YPDA液体培养基中，30 ℃培养20～24 h。收集菌体，使用10 mL 0.5×YPDA液体培养基悬浮共培养的菌体，并涂布于含3-AT的SD/-Trp/-Leu/-His平板，30 ℃培养5 d。筛选平板长出的菌落进行挑取，转接3次到SD/-Trp/-Leu/-His平板上。挑取剩下活的菌落，接种于SD/-Trp/-Leu液体培养基中，30 ℃、250 r/min培养20～24 h，收集菌体提取酵母质粒。质粒转化DH5α大肠杆菌并提取质粒送测序。

1.2.10  阳性克隆cDNA的注释  采用本地Blast的方式，将测序获得的阳性克隆cDNA序列与剑麻H.11648的转录组序列进行比对，根据转录组的注释信息，获得候选互作蛋白的功能等信息。

2  结果与分析

2.1  总RNA的提取

提取的剑麻总RNA经1%琼脂糖凝胶检测，结果显示28S和18S条带清晰，RNA未降解（图1A）;OD260/OD280比值为1.95，表明提取的总RNA纯度和质量较高，可用于后续实验。

2.2  cDNA的合成及纯化

分别在合成双链cDNA的第21～26个循环取5 μL PCR产物，经1%琼脂糖凝胶检测，结果显示，第21和第22个循环的PCR产物不明显，从第23个循环开始，PCR产物明显且浓度逐渐增加（图1B）。合成的cDNA片段分布于0.2～5.0 kb之间，且主要集中在1.0 kb左右。对第26个循环合成的双链cDNA进行纯化，纯化的双链cDNA中0.5 kb以下小片段含量明显降低（图1C），纯化的双链cDNA总量为4.26 μg（213 ng/μL）。

2.3  文库构建及质量检测

Image J软件统计100 μL 102倍的文库稀释液在SD/-Leu平板上平均长出了650个单菌落（图2A），文库总容量为3.9106 CFU，转化效率为9.15105 CFU/μg pGADT7-Rec。100倍稀释液经镜检，80个小格共计27个酵母细胞，文库细胞密度为1.35×108/mL。Image J软件统计50 μL 104倍的文库稀释液在SD/-Leu平板上平均长出了111个单菌落（图2B），文库滴度为2.22107 CFU/ mL。菌落PCR产物经1%琼脂糖电泳检测，结果显示插入片段在0.5～3.0 kb之间，少量酵母菌含有多个重组质粒（图2C），重组率为92%。

2.4  诱饵载体构建

pGBKT7-AhKNOX2载体经Nde I和BamH I内切酶双酶切出现900 bp左右条带（图3A），测序结果表明，插入片段即为AhKNOX2的編码框，双酶切和测序结果说明诱饵载体构建成功。

2.5  自激活检测

阳性对照可在4个培养基上生长（p53蛋白和T-antigen相互作用）。阴性对照仅在SD/-Trp和SD/-Leu培养基上生长（Lam和T-antigen不相互作用）。空载体对照（pGBKT7）仅能在SD/-Trp培养基上生长。含有pGBKT7-AhKNOX2载体的Y2HGold酵母可在SD/-Trp培养基生长，在SD/-Leu和SD/-Trp/-Ade培养基上不生长，但在SD/-Trp/- His培养基上生长了少量的菌落（图3B），结果表明，诱饵载体没有激活报告基因ADE2的表达，但激活了报告基因HIS3的表达，存在自激活性。

2.6  3-AT抑制浓度筛选

由于KNOX2存在自激活性，能激活His的表达，使Y2HGold酵母能在缺His（组氨基酸）的培养基生长，因此，采用在培养基中加入3-AT来抑制自激活。含有pGBKT7-AhKNOX2载体的Y2HGold酵母能在不含3-AT的SD/-Trp/-His培养基上生长，而在加了5 mmol/L及更高浓度3-AT的SD/-Trp/-His培养基上不能生长（图4）。由此可知，5 mmol/L的3-AT就能抑制诱饵载体的自激活性。

2.7  互作蛋白筛选

经SD/–Trp/–Leu/–His/+5 mmol/L 3-AT培养基的筛选，获得16个与AhKNOX2相互作用的阳性克隆，将阳性克隆cDNA测序序列与剑麻转录组数据比对，获得与AhKNOX2相互作用蛋白的cDNA注释信息（表2）。根据候选蛋白的功能，可分为蛋白/DNA结合蛋白、蛋白/RNA结合蛋白、核苷酸结合蛋白、蛋白质代谢、蛋白质加工、碳水化合物代谢、光形态建成和未知蛋白8大类。

3  讨论

酵母双杂交是目前能够高通量筛选相互作用蛋白的技术之一。但大多数转录因子具备转录激活功能，这就导致构建的诱饵载体往往存在自激活，因此抑制诱饵载体的自激活是降低假阳性的关键之一。本研究采用的是Clontech公司的Matchmaker? Gold酵母双杂交系统，该系统采用3个异源的Gal4响应启动子元件（G1、G2和M1）控制HIS3、ADE2、MEL1/AUR1-C 4个报告基因的表达，目的是通过增加报告基因来降低筛选结果的假阳性。3-AT是HIS3蛋白的竞争性抑制剂，能够抑制组氨酸的合成[25-26]。如果在实验过程中发现诱饵载体存在自激活，可通过在筛选培养基中增加3-AT来抑制由诱饵蛋白激活表达的HIS3蛋白的活性，减少自激活背景[27]。本实验发现构建的pGBKT7-AhKNOX2存在自激活性，启动了HIS3报告基因的表达，向SD/–Trp/–His培养基中添加5 mmol/L的3-AT能抑制其自激活能力，因此将SD/–Trp/–Leu/–His/+5 mmol/L 3-AT培养基作为文库筛选培养基。

KNOX蛋白能形成同源或者异源二聚体，通过改变亚细胞定位实现调控作用。从KNOX蛋白的结构域功能看，MEINOX结构域对形成二聚体起重要作用，ELK结构域参与蛋白质之间的相互作用，而HD结构域参与DNA的结合和同源二聚体的形成[7]，表明KNOX蛋白能形成同源或者异源二聚体，而蛋白质相互作用往往会改变复合体的亚细胞定位。研究发现，KNOX与BELL相互作用形成异源二聚体，进入细胞核，从细胞质移动到细胞核依赖于二者形成复合物[28]。拟南芥OFPs（Arabidopsis thaliana ovate family proteins）与KNAT1蛋白相结合，将KNAT1蛋白从细胞核中移动至细胞质中的微管上[29]。KNATM与KNOX的结合，阻止了KNOX进入细胞核[30]。本研究通过酵母双杂交筛选获得16个与AhKNOX2相互作用的候选蛋白，16个候选蛋白中没有同源异型盒基因家族蛋白，表明AhKNOX2与候选蛋白形成异源二聚体发挥作用。

KNOX可通過蛋白质相互作用参与调控植物发育的多个事件，目前发现与KNOX相互作用的蛋白主要是转录因子，如与SH5相互作用抑制木质素的合成，调控落果[20];与OFP和MYB转录因子相互作用，调控纤维细胞和次生细胞壁发育[16-17， 19];与NAC直接相互作用，抑制其下游基因CESAs等的表达，调控细胞壁加厚[21];与水稻生长调控因子GRF4互作，抑制其下游基因Expansin等的表达，调控细胞扩展[21];与KNOX同源蛋白间相互作用，调控开花[31-32]。本研究通过筛选，一共获得16个阳性克隆，其中3个为转录因子（MADS、VOZ、bHLH），AhKNOX2与这些蛋白的相互作用在剑麻中的具体功能还有待深入研究。

参考文献

[1] Li P H， Ponnala L， Gandotra N， et al. The developmental dynamics of the maize leaf transcriptome[J]. Nature Genetics， 2010， 42（12）： 1060-1067.

[2] 孙海龙， 侍  婷， 章  镇， 等. KNOXⅠ类基因在雌蕊发育中的作用[J]. 江苏林业科技， 2012， 39（5）： 39-44.

[3] Zhao Y， Ma Q， Jin X L， et al. A novel maize homeodomain-leucine zipper （HD-Zip） I gene， Zmhdz10， positively regulates drought and salt tolerance in both rice and Arabidopsis[J]. Plant Cell Physiology， 2014， 55（6）： 1142-1156.

[4] Shafiullah M D， Lacroix C R. Extended expression of MaKN1 contributes to the leaf morphology in aquatic forms of Myriophyllum aquaticum[J]. Botany， 2015， 93（9）： 611- 621.

[5] 朱钦士. 植物和动物的殊途同归（2）[J]. 生物学通报， 2017， 52（11）： 12-15.

[6] Du F， Guan C F， Jiao Y L. Molecular mechanisms of leaf morphogenesis[J]. Molecular Plant， 2018， 11（9）： 1117-1134.

[7] Sano R， Juárez C M， Hass B， et al. KNOX homeobox genes potentially have similar function in both diploid unicellular and multicellular meristems， but not in haploid meristems[J]. Evolution & Development， 2005， 7（1）： 69-78.

[8] Kerstetter R， Vollbrecht E， Lowe B， et al. Sequence analysis and expression patterns divide the maize knotted1-like homeobox genes into two classes[J]. The Plant Cell， 1994， 6（12）： 1877-1887.

[9] Ramirez J， Bolduc N， Lisch D， et al. Distal expression of knotted1 in maize leaves leads to reestablishment of proximal/distal patterning and leaf dissection[J]. Plant Physiology， 2009， 151（4）： 1878-1888.

[10] Kalve S， De V D， Beemster G T S. Leaf development： a cellular perspective[J]. Frontiers in Plant Science， 2014， 5： 362.

[11] Bolduc N， Hake S. The maize transcription factor KNOTTED1 directly regulates the gibberellin catabolism gene ga2ox1[J]. The Plant Cell， 2009， 21（6）： 1647-1658.

[12] Ma C， Meir S， Xiao L T， et al. A KNOTTED1-LIKE HOMEOBOX protein， KD1， regulates abscission in tomato by modulating the auxin pathway[J]. Plant Physiololgy， 2015， 167（3）： 844-853.

[13] Townsley B T， Sinha N R， Kang J. KNOX1 genes regulate lignin deposition and composition in monocots and dicots[J]. Frontiers in Plant Science， 2013， 4： 121.

[14] Woerlen N， Allam G， Popescu A， et al. Repression of BLADE-ON-PETIOLE genes by KNOX homeodomain protein BREVIPEDICELLUS is essential for differentiation of secondary xylem in Arabidopsis root[J]. Planta， 2017， 245（6）： 1079-1090.

[15] Li E Y， Bhargava A， Qiang W Y， et al. The Class II KNOX gene KNAT7 negatively regulates secondary wall formation in Arabidopsis and is functionally conserved in Populus[J]. New Phytologist， 2012， 194（1）： 102-115.

[16] Bhargava A， Ahad A， Wang S， et al. The interacting MYB75 and KNAT7 transcription factors modulate secondary cell wall deposition both in stems and seed coat in Arabidopsis[J]. Planta， 2013， 237（5）： 1199-1211.

[17] Gong S Y， Huang G Q， Sun X， et al. Cotton KNL1， encoding a class II KNOX transcription factor， is involved in regulation of fibre development[J]. Journal of Experimental Botany， 2014， 65（15）： 4133-4147.

[18] Kuijt S J， Greco R， Agalou A， et al. Interaction between the GROWTH-REGULATING FACTOR and KNOTTED1- LIKE HOMEOBOX families of transcription factors[J]. Plant Physiology， 2014， 164（4）： 1952-1966.

[19] Liu Y， Douglas C J. A role for OVATE FAMILY PROTEIN1 （OFP1） and OFP4 in a BLH6-KNAT7 multi- pro?tein complex regulating secondary cell wall formation in Arabidopsis thaliana[J]. Plant Signaling Behavior， 2015， 10（7）： e1033126.

[20] Yoon J， Cho L H， Antt H W， et al. KNOX protein OSH15 induces grain shattering by repressing lignin biosynthesis genes[J]. Plant Physiology， 2017， 174（1）： 312-325.

[21] Wang S H， Yang H L， Mei J S， et al. A rice homeobox protein KNAT7 integrates the pathways regulating cell expansion and wall stiffness[J]. Plant Physiology， 2019， 181（2）： 669-682.

[22] Abraham-Juárez M J， Martínez-Hernández A， Leyva-Gon-zález M A， et al. Class I KNOX genes are associated with organogenesis during bulbil formation in Agave tequilana[J]. Journal of Experimental Botany， 2010， 61（14）： 4055-4067.

[23] Zhou W Z， Zhang Y M， Lu J Y， et al. Construction and evaluation of normalized cDNA libraries enriched with full-length sequences for rapid discovery of new genes from sisal （Agave sisalana Perr.） different developmental stages[J]. International Journal of Molecular Sciences， 2012， 13（10）： 13150-13168.

[24] Gross S M， Martin J A， Simpson J， et al. De novo transcriptome assembly of drought tolerant CAM plants， Agave deserti and Agave tequilana[J]. BMC Genomics， 2013， 14： 563.

[25] Fields S. The two-hybrid system to detect protein-protein interactions[J]. Methods， 1993， 5（2）： 116-124.

[26] Durfee T， Becherer K， Chen P L， et al. The retinoblastoma protein associates with the protein phosphatase type 1 catalytic subunit[J]. Genes Development， 1993， 7（4）： 555-569.

[27] Shan C M， Shangguan X X， Zhao B， et al. Control of cotton fibre elongation by a homeodomain transcription factor GhHOX3[J]. Nature Communications， 2014， 5： 5519.

[28] Kumar R， Kushalappa K， Godt D， et al. The Arabidopsis BEL1-LIKE HOMEODOMAIN proteins SAW1 and SAW2 act redundantly to regulate KNOX expression spatially in leaf margins[J]. The Plant Cell， 2007， 19（9）： 2719-2735.

[29] Hackbusch J， Richter K， Müller J， et al. A central role of Arabidopsis thaliana ovate family proteins in networking and subcellular localization of 3-aa loop extension homeodomain proteins[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 2005， 29， 102（13）： 4908-4912.

[30] Magnani E， Hake S. KNOX lost the OX： the Arabidopsis KNATM gene defines a novel class of KNOX transcriptional regulators missing the homeodomain[J]. The Plant Cell， 2008， 20（4）： 875-887.

[31] Smith H M， Hake S. The interaction of two homeobox genes， BREVIPEDICELLUS and PENNYWISE， regulates internode patterning in the Arabidopsis inflorescence[J]. The Plant Cell， 2003， 15（8）： 1717-1727.

[32] Ragni L， Belles-Boix E， Günl M， et al. Interaction of KNAT6 and KNAT2 with BREVIPEDICELLUS and PENNYWISE in Arabidopsis in?orescences[J]. The Plant Cell， 2008， 20（4）： 888-900.