miR-144-5p对人结肠癌细胞生长和转移的抑制作用及机制

王鑫鹏 崔现 (赤峰市医院肛肠外科，内蒙古 赤峰 04000；延边大学附属医院肿瘤科)

结肠癌也称为大肠腺癌，是第五大致命癌症，2018年预计死亡551 000例，占所有癌症死亡的5.8%〔1〕。在发展中国家，其发病率正在稳步上升。结肠癌0～74岁时，死于结肠癌的累积风险在男性中为0.66%，女性为0.44%〔1〕。尽管有许多治疗方法，如外科手术、外科手术结合化学疗法和放射疗法，但结肠癌的中位生存率仍然很差。微小RNA(miRNA)是一种内源性的小RNA分子，长度为18～25 nt。miRNA与靶基因mRNA的3′端非转录区域结合后，可介导其降解或抑制其转录，因此起到调控基因功能的作用〔2〕。大量研究发现，miRNA参与了包括结肠癌在内的多种肿瘤的发生发展，靶向miRNA可作为治疗肿瘤的潜在手段〔3～6〕。本研究检测一种miRNA分子miR-144-5p在结肠癌中的表达，并研究其对结肠癌细胞生长、抗凋亡和转移的影响，旨在为结肠癌分子靶向治疗提供一种新的手段。

1 材料和方法

1.1实验细胞 人结肠癌细胞系SW480细胞购自ATCC公司，培养基为10%胎牛血清的 DMEM 完全培养基，培养于37℃含5% CO2的培养箱中，每3天传代1次。

1.2主要试剂和仪器 细胞培养基购自Gibco公司，胎牛血清购自BI公司，噻唑蓝(MTT)试剂购自碧云天科技有限公司，逆转录试剂盒和SYBR Green PCR预混液购自莫纳公司。TRIzol购自Invitrogen公司。流式细胞仪购自美国Beckman公司。

1.3MTT分析 将转染了miRNA的SW480细胞接种在96孔板上，然后用15 μlMTT(5 mg/ml)处理4 h。然后除去含有MTT溶液的培养基，再次添加150 μl二甲基亚砜(DMSO)。然后使用550型酶标仪(Bio-Rad，PA，USA)测定490 nm处的分光光度吸光度。每个测定重复3次。

1.4凋亡测定 转染后，通过离心收集细胞并用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤。每个样品都用FITC-Annexin V和碘化丙啶(PI)双重染色。以1 mg/ml最终浓度添加FITC-Annexin V(Boehringer Mannheim，德国Mannheim)，然后添加10 mg/ml PI。将混合物在黑暗中于室温下孵育15 min，并使用FACScan流式细胞仪对1×104个细胞的荧光进行定量。每个测定重复3次。

1.5RNA提取和RT-PCR 使用Trizol试剂(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)从细胞中提取总RNA。使用EasyScript第一链cDNA合成SuperMix(TransGen Biotech，北京，中国)合成cDNA，并将其用作定量实时聚合酶链反应(qRT-PCR)中的模板。使用TransStartTMSYBR Green qPCR Supermix(TransGen Biotech)在7300 PCR系统(ABI，卡尔斯巴德，美国)上进行PCR反应。 miR-144-5p引物和内部参考U6购自广州日宝生物技术有限公司(中国广州)。使用2-ΔΔCt方法计算相对RNA水平。

1.6菌落形成试验 用菌落形成测定法测定细胞的克隆形成性。将细胞接种到3.5 cm板中。处理后，将细胞在细胞培养基中培养。每3天更换一次新培养基。温育14 d后，计数包含直径大于75 μm的球体孔数量。实验进行3次。

1.7细胞刮擦测试 在用miRNA转染后，将SW480细胞处理的无血清培养基培养到6孔板中。当细胞生长至90%汇合时，沿标记线刮擦板表面；将细胞用PBS漂洗2次，并洗去浮细胞。然后将细胞添加到McCoy的5a培养基中，并置于37°C的5%CO2培养箱中，并在饱和湿度环境下进行培养。在倒置显微镜下分别在0 h和24 h对细胞照相。使用Imagetool软件计算愈合面积，愈合率=(初始划痕宽度-已存在的划痕宽度)/初始划痕宽度×100%。

1.8统计学分析 使用GraphPad Prism7.0软件进行方差分析及q检验。

2 结 果

2.1miR-144-5p在结肠癌组织中的表达 肿瘤组织中miR-144-5p表达水平(0.31±0.17)明显低于正常组织(1.00±0.22，P<0.01)。 在Ⅲ～Ⅳ期结肠癌组织中，miR-144-5p表达(0.22±0.10)明显低于Ⅰ期和Ⅱ期(0.54±0.20、0.43±0.14，P<0.01)。

2.2miR-144-5p在体外抑制迁移和侵袭 细胞刮擦试验结果表明，与用扰乱的miRNA转染的细胞相比，用miR-144-5p模拟物转染的SW480细胞的刮擦修复率更低，如图1。

图1 miR-144-5p抑制体外迁移(×200)

2.3miR-144-5p抑制SW480细胞的增殖并促进其凋亡 用miR-144-5p转染的SW480细胞活力(0.37±0.09)明显低于Scramble转染的SW480细胞(0.94±0.16，P<0.01)。miR-144-5p转染在体外显著增强了SW480细胞的自发凋亡，miR-144-5p组细胞凋亡(17.2%)明显高于Scramble组(5.8%)及对照组(5.4%，P<0.01)。结果表明，miR-144-5p可以调节SW480细胞的增殖和凋亡。

2.4miR-144-5p抑制SW480细胞中集落形成和肿瘤生长 菌落形成试验表明，增强的miR-144-5p表达使菌落形成数目〔(58.4±6.9)个〕明显少于Scramble组〔(118.2±10.1)个〕和对照组〔(123.4±10.7)个，P<0.01〕。裸鼠成瘤实验结果表明，miR-144-5p的给药极大地抑制了SW480肿瘤异种移植的生长，miR-144-5p组肿瘤体积〔(692.7±96.3)mm3〕明显低于Scramble组〔(189.6±137.2)mm3〕和对照组〔(1 134.2±148.4)mm3,P<0.01〕。

3 讨 论

最近研究表明，miR-144-5p可作为疾病中的有效生物标志物〔3～8〕。Satoh等〔3〕报道，与健康人相比，阿尔茨海默病患者血液样本中的miR-144-5p和其他26种miRNA的表达失调，这可能与神经元突触功能有关。与健康对照组相比，抑郁/焦虑症患者的血浆miR-144-5p水平显著降低，且与抑郁评分呈负相关〔4〕。在各种类型的肿瘤中也发现了异位miR-144-5p表达，包括甲状腺癌〔5〕、食道癌〔6〕、乳腺癌〔7〕和胃癌〔8〕。但在结肠癌中的表达仍然未知，研究发现结肠癌和结肠癌细胞系中miR-144-5p表达的水平显著下调，与具有较高miR-144-5p表达的患者相比，具有较低miR-144-5p的患者表现出较高的Ki67指数和较短的PFS，结果强烈表明miR-144-5p可作为预测结肠癌预后的有价值的生物标志物〔8〕。

通过Dicer1对pre-miRNA进行加工会生成一个miRNA双链体，该双链体由引导链和过客链组成。通常，传代链miRNA没有调节活性。但传代链miR-144-3p的抑癌作用已有充分文献记载〔9～13〕，而对miR-144-5p(来自pre-miR-144的引导链)的功能的了解仍然很少。据报道，miR-144-5p抑制人单核细胞和巨噬细胞中针对结核分枝杆菌的抗微生物反应。Matsushita等〔14〕报道，miR-144-5p在膀胱癌中被下调，功能获得研究表明miR-144-5p抑制癌细胞的增殖。本文结果表明，miR-144-5p表达的恢复不仅在体内外都诱导了结肠癌细胞的增殖抑制、凋亡和生长停滞，而且还抑制了结肠癌细胞的迁移和侵袭能力。

综上，miR-144-5p在体外和体內能有效抑制结肠癌细胞的生长，并在体外促进其自发凋亡。另外miR-144-5p还可以抑制肿瘤的迁移和侵袭。靶向miR-144-5p可能是预防结肠癌进展的有效策略。