大肠杆菌的分离鉴定及药敏试验

徐辉 王丽霞 李生龙

摘要 为进一步确诊临床发病鸡的病原，无菌条件下取肝脏，进行细菌的分离、培养及鉴定。鉴别培养基培养结果显示，分离菌株在伊红美蓝培养基上出现带有金属光泽的菌落特征，在麦康凯培养基显示出粉红色菌落的特征。结果表明，7只患病鸡均为大肠杆菌感染。然后，针对分离纯化的菌株进行药敏试验。西药药敏试验结果显示，硫酸庆大霉素、阿米卡星、硫酸新霉素、安普霉素均为高敏，阿莫西林耐药，而盐酸多西环素和恩诺沙星为中敏。中药药敏试验结果显示，四黄止痢颗粒和杨树花口服液对分离菌株比较敏感。该试验结果可为大肠杆菌病的临床用药提供参考。

关键词 病鸡;大肠杆菌;分离与鉴定;药敏试验;药物筛选

中图分类号 S858.31  文献标识码 A  文章编号 0517-6611（2020）19-0084-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.19.023

Abstract In order to further confirm the pathogen of diseased chicken in the clinic， the liver was collected under aseptic conditions to make the laboratory isolation，culture and identification of bacteria. The results of different culture media showed that the isolated strains showed the colony characteristic of metallic luster on EMB medium，  and the MAC medium showed the characteristics of pink colony. The results showed that all seven infected chicken were infected with Escherichia coli. The drug sensitivity test results of western medicine showed that the gentamycin sulfate， amikacin， neomycin sulfate， and apramycin were highly sensitive to isolated strains， amoxicillin was tolerant to isolated strains， and doxycycline hydrochloride and enrofloxacin were intermediately sensitive to isolated strains. The sensitive test results of traditional Chinese medicine showed Sihuang Zhili Granules and Yangshuhua Oral Liquid were more sensitive to isolated strains. This experimental results could provide references for the clinical medication of colibacillosis.

Key words Sick chicken;Escherichia coli;Separation and identification;Drug sensitivity test;Drug screening

作者簡介 徐辉（1980—），男，安徽宿州人，兽医师，从事畜牧兽医技术推广、动物检疫和动物卫生监督执法工作。

收稿日期 2020-07-14

大肠杆菌是微生物界普遍存在的一种微生物，它主要寄生于人和动物肠道中，一般分为致病性大肠杆菌和非致病性大肠杆菌，一般正常的禽类体内都会存在大肠杆菌潜在基因。大肠杆菌能引起禽类多种疾病，每年对养殖业和畜牧业都会造成巨大的经济损失，随着养殖场对抗生素的普遍应用，大肠杆菌不断产生耐药性，已经成为社会关注的热点之一。大肠杆菌病的主要表现为精神颓废、不能长时间站立、不食或厌食、头部耷拉、呆立或蹲伏不动、肛门周围羽毛沾有绿色或浅黄色稀粪。当鸡体的免疫系统下降或者鸡体的皮肤防御系统遭到破坏，就会传染给其他鸡群，导致大肠杆菌的大量繁殖，从而引发大肠杆菌类似疾病。病鸡排出的细菌，也会经过空气、粪便、饮水等方式传染给健康鸡群[1]。大肠杆菌这类疾病还是以预防为主，在养殖过程中应注意场地的卫生环境，同时加强养殖场的饲养管理和饮水卫生，除了对鸡群进行科学的饲养管理、做好日常清洁、消毒等工作外，合理使用药物也是防治该病的关键。

由于大肠杆菌对多种青霉素、磺胺类、氨基糖苷类都比较敏感[2]，所以社会广泛使用敏感的抗生素对大肠杆菌来进行治疗，这些年来由于抗生素的不正当使用，不仅造成耐药菌株的不断增加和抗生素的极大浪费，同时延长的治疗时间也给养殖业和畜牧业带来了严重的经济负担，所以在临床上合理使用抗生素非常有必要，同时中药制剂在临床上的应用研究也不断深入，如果筛选出有效的抗菌组方，就能减少抗生素给社会带来的负面影响。

目前兽药药物的残留问题也越来越受到人们的关注，已经成为社会热点问题，尤其是肉鸡与蛋鸡的药物残留问题一直是国家有关部门严格监察的问题，鉴于目前养殖场对抗生素的广泛使用，而蛋鸡在产蛋期患病可用药物较少，养殖户迫于对疾病的治疗和利益的追求，会选择一些蛋鸡禁用抗生素来进行治疗，从而导致动物源性食品质量的不安全，还有患病动物长期服用抗生素可在体内残留累积药残，人类食用含抗生素残留的动物产品也会引起过敏反应，间接致病，严重时甚至能引起人类的生命安全。尽管抗生素在很大程度上能起到很好的治疗效果，但长期使用抗生素会使鸡大肠杆菌的耐药菌种不断出现和耐药谱的不断增加[3]，治疗效果事倍功半，而中药由于无耐药性[4]，近年来在治疗禽类大肠杆菌病症中通过兽医工作者的大量试验已经取得显著的效果。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料来源。

在实习期与安徽华澳生物技术有限公司合作的数个养殖场送来数只疑似患有大肠杆菌疾病的病鸡，其中包括安徽省肥西县、六安市、亳州市、池州青阳县、宿州市等。

1.1.2 临床诊断。

对送检病鸡的精神状况、采食饮水情况以及粪便情况进行观察，主要表现为不食或厌食、精神萎靡不振、头部耷拉呆立或蹲伏不动、肛门周围羽毛沾有绿色或浅黄色稀粪，不能长时间站立。在无菌条件下对患鸡进行解剖，观察病变的器官组织。

1.1.3 试验耗材与仪器。

试验所用耗材有解剖剪、接种环、消毒棉签、消毒镊子、酒精灯、灭菌试管、培养皿、牛津杯、移液枪及枪头等;试验所用仪器有分析电子天平、百分电子天平、数控超声波清洗器、高压蒸汽灭菌锅、电热恒温培养箱、电热鼓风干燥箱、旋转蒸发仪、水浴加热锅、水浴恒温振荡器、超净工作台等。

1.1.4 试剂。

生理盐水、麦康凯琼脂培养基（MAC）、伊红美蓝琼脂培养基（EMB）、三糖铁琼脂（TSI）、大肠杆菌生化鉴定管、营养琼脂培养基、营养肉汤培养基、革兰氏染液等。

1.1.5 病原菌获取。

在实习期间安徽华澳生物技术有限公司各地区技术员从其负责区域养殖场送来数只疑似患有大肠杆菌病的病鸡，经剖检观察病鸡初步诊断是否患有大肠杆菌症状，在无菌环境下取其病变的器官（如肝脏、心脏或分泌物），并将对应的病鸡做好标记，然后将采集的病料及时放于冰箱中冷藏备用。

1.1.6 药品配制。

参照CLSI标准、兽药国家标准和中华人民共和国兽药典（2015年版）一部确定各种抗生素母液所用药物原料的有效含量（或单位效价）及溶剂稀释剂方法[5]。该试验所制母液的理想浓度为1 024 μg/mL，根据理论母液浓度计算出配制100 mL母液所需的原药质量，具体配制方法见表1[6]，计算公式如下：

母液理想浓度=药物原料质量×效价1 024 μg/mL=100 mL

鸭浆宁：称取50 g样品，加入10倍量的水，水浴蒸煮1 h，在同样条件下提取3次，将3次所得提取液进行统一抽滤，然后将其旋转蒸发浓缩至50 mL待用。

大杆康：称取30 g样品加入100 mL水，搅拌溶解待用。

杨树花口服液：取安徽华澳生物技术有限公司生产的杨树花口服液，摇匀待用。

四黄止痢颗粒：称取100 g样品，加入100 mL水，搅拌溶解待用。

在微生物室无菌环境下将配制好的药液分别用无菌注射器吸取后，再装入0.22 μm无菌滤头进行过滤，然后将过滤好的药液分装到经高压灭菌的离心管中，按压封紧，用记号笔标记好相应药物，置于-20 ℃冰箱中保存备用。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分离与培养。

将病料从冰箱取出，用灭菌后的解剖剪刀剪去病料表面被污染的部分，再用消毒过的棉签沾取病变器官内的组织液，分别在麦康凯琼脂培养基和伊红美蓝琼脂培养基上面进行涂抹，形成十字区域，接种完成后于恒温箱37 ℃培养18～24 h，观察菌落生长形态。

1.2.2 病原菌的镜检。

采用革兰氏染色法对病原菌进行染色镜检，革兰氏染色具体步骤如下。

1.2.2.1 初染。点燃酒精灯，将载玻片用洗瓶先冲洗干净，用吸水纸擦干或自然晾干，再用接种环从伊红美蓝培养基或者麦康凯琼脂培养基挑取单个菌落涂抹于载玻片中心区域，涂抹成薄薄的一层，然后滴加草酸铵结晶紫染液到涂菌部位，染色2 min后，用洗瓶冲洗数次。

1.2.2.2 媒染。加碘液，保存1 min，再倾斜载玻片倾去碘液，最后用洗瓶冲洗至无色。

1.2.2.3 脱色。用吸水纸将载玻片上的水吸干或者自然晾干，然后再用95%乙醇脱色，持续30 s后立即洗去95%乙醇。

1.2.2.4

复染。将载玻片上的水自然晾干或用吸水纸吸干，再用番红复染色2 min，水洗，最后用吸水纸吸干。

1.2.2.5

结果观察。将载玻片涂上香柏油，置于显微镜下由低倍切换到高倍镜观察。

1.2.3 病原菌的生化鉴定。

选取从麦康凯琼脂培养基上长出的粉红色菌落或者伊红美蓝琼脂培养基上长出的黑色带有金属光泽的菌落接种到三糖铁培养基中恒温37 ℃培养18～20 h，检查该菌株对糖的发酵能力、是否产酸产气，如果有相应现象产生，则表明该菌种是大肠杆菌。

1.2.4 大肠杆菌的药敏试验。

1.2.4.1 菌液的制备。

用接種环分别挑取EMB培养基上的单个紫黑色菌落接种到营养肉汤培养中，在水浴振荡培养箱中37 ℃恒温培养8 h左右，然后用紫外可见分光光度计在波长600 nm处测定菌液OD值，最好用营养肉汤进行校零。

①吸取0.5 mL菌液加入到9.5 mL营养肉汤中，混匀后检测OD600 nm是否介于0.08～0.10。

②根据测定数值结果，调整原培养液浓度（用营养肉汤稀释原培养液以降低OD600 nm值或者延长原培养液的培养时间来升高OD600 nm值）。

③用于点板的菌液需在上述步骤稀释所得的混合液基础上再稀释1 000倍或直接使用原培养液稀释10 000倍。

1.2.4.2 药物 MIC的测定。

①无菌96孔板第1行加入200 μL营养肉汤，第2行加入100 μL营养肉汤+100 μL制备的菌液，第3～8行加入100 μL营养肉汤。

②第3～8行每行第一孔加入一种抗生素母液100 μL，逐次倍比稀释至第12孔，最后从每行第12孔弃掉100 μL。

③第3～8行每孔加入100 μL制备菌液。

④制备菌液和抗生素上样完毕后盖好板盖，37 ℃恒温孵育12～20 h后观察结果。

结果判读：当第1行所有孔无细菌生长、第2行所有孔有细菌生长时，第3～8行每行最后一清亮孔所对应的药物浓度为该药的MIC。当出现跳孔现象，若为单一跳孔，记录最高MIC，若为多处跳孔，则此行无效，不报告该种药物的MIC。当第1行有孔出现细菌生长现象，同样不应该报告该板所检测的各抗菌药物的MIC。

1.2.4.3 牛津杯法检测。

在超净工作台中，打开送风，点燃酒精灯，将普通琼脂培养基倒入7个培养皿中并铺平，待其完全凝固即可，然后，用消毒过的棉签沾取每株病原菌于培养皿中轻轻涂抹，呈十字区域;然后，用记号笔在培养皿底部分成5块区域，每块区域分别标注为鸭浆宁、大杆康、杨树花口服液、四黄止痢颗粒、新霉素（西药对照）;用消毒过的镊子往每块培养皿上放上5个灭菌的牛津杯，轻轻按压，使其与培养皿表面贴合无空隙[7]，分别加入各试验用药200 μL，完成后将其置于37 ℃培养箱中培养10～12 h后再观察结果。

1.2.4.4 药物敏感试验判定标准。

中药细菌抑菌圈直径标准判定如下：若抑菌圈直径>20 mm，判为极敏;若抑菌圈直径为15～20 mm，判为高敏;若抑菌圈直径为10～14 mm，判为中敏;若抑菌圈直径为0～10 mm，判为低敏;若抑菌圈直径为0，判为不敏。

2 结果与分析

2.1 临床诊断结果

对送检病鸡的精神状况、采食饮水情况及粪便情况进行观察，可见病鸡个别头部耷拉、精神萎靡、呆立不动（图1A）;病鸡解剖结果见图1B、C。

2.2 病原菌鉴定结果

经选择性培养基分离培养后，结果发现此病菌接种在普通琼脂培养基上培养18～24 h，形成圆形、湿润、半透明、隆起的乳白色中等大小菌落;在伊红美蓝培养基上长出黑色稍凸圆形菌落，直径大小约2～5 mm，菌落边缘整齐且表面光滑湿润，并带有金属光泽（图2A）[8];在麦康凯培养基上长出边缘整齐且表面光滑湿润的粉红色菌落，直径2～5 mm圆形凸起（图2B）[9];然后，再挑取典型的大肠杆菌单株菌落在营养肉汤培养基上传代培养2～3代，使细菌生长稳定，状态良好。最后，经过肉汤培养的病原菌标号分别为C-1、C-2、C-3、C-4、C-5、C-6、C-7。

2.3 病原菌的镜检结果

经镜检，病原菌革兰氏染色结果为阴性杆菌，如图3所示。

2.4 病原菌的生化鉴定结果

通过对病原菌进行三糖铁生化鉴定，结果显示为斜面和底层产酸，不产硫化氢，靛基质试验和甲基红试验结果均呈阳性，VP试验和西蒙氏柠檬酸盐试验结果均呈阴性，符合大肠杆菌生化特性，表明该病原菌为典型的大肠埃希氏菌。

2.5 微量肉汤稀释法检测MIC结果

用灭菌96孔板测定

试验分离纯化出的7株大肠杆菌，各孔板阴性对照均未见细菌生长，阳性对照的细菌在孔内生长情况良好，各抗菌药对大肠杆菌的MIC（最低抑菌浓度）见表2。

由表2可知，96孔板试验结果显示硫酸庆大霉素、阿米卡星、硫酸新霉素和安普霉素对分离的7株大肠杆菌的MIC值较其他药物更低。

2.6 牛津杯法检测结果

通过牛津杯法检测试验所选中药对7株大肠杆菌的药敏性[10]，结果见表3、4。

由表3可知，该试验所用中药对分离的大肠杆菌菌株都有不同程度的敏感性，其中四黄止痢颗粒、杨树花口服液对每株菌种均具有极高的敏感性，与新霉素的敏感度一致;鸭浆宁和大杆康只对某些菌株有很高的敏感性。

从大肠杆菌药物敏感试验结果（表4）可知，四黄止痢颗粒和杨树花口服液与对照硫酸新霉素的敏感度相同，均为100%;鸭浆宁和大杆康敏感度低于杨树花口服液、四黄止痢颗粒和硫酸新霉素，分别为85.7%和71.4%，由此可见中药组方优先选用杨树花口服液和四黄止痢颗粒。

3 讨论

3.1 临床耐药菌产生的原因

大肠杆菌是一种无芽孢的革兰氏阴性菌，常见的肠道感染菌种之一，在正常的鸡体内也会存在潜在大肠杆菌，当鸡体的皮肤防御系统遭到破坏和免疫系统降低时，鸡群便会遭到感染，再传染给其他鸡群，从而诱发大肠杆菌类疾病。为了能快速控制鸡群疾病，养殖场会优先使用新一代抗生素或大剂量、大组方进行治疗，长期以往容易导致细菌产生耐药性。近些年，大肠杆菌的耐药率和耐药谱不断增高，而且目前被发现的大肠杆菌的血清型有很多种[11]，很大程度上增加了兽医工作者的工作难度，还间接导致食品安全问题的越来越严重，尤其是蛋鸡和肉鸡携带的耐药基因会通过食物链等方式传给人类[12]，危害食品安全和人类健康。该试验结果显示各种抗菌药物对不同地区的大肠杆菌病原菌的敏感度不一样，产生的原因应该是與各地区的用药史有关，由于检测的病鸡来源于不同地区，所以导致不同地区的大肠杆菌对各种药物的敏感度不一样[13]。通过药敏试验可选择发病场的敏感药物对患有大肠杆菌病的鸡群进行治疗，能达到较好的治疗效果，也能避免细菌耐药性的产生。

3.2 减少药物残留的方法

随着抗生素的广泛使用，药物的残留导致动物源性的食品安全问题越来越严重，尤其体现在蛋鸡和肉鸡上，它们体内携带的耐药基因和药物残留会通过食物链等方式传给人类，严重危害食品安全和人类健康[14]。中药组方或单方治疗模式便应运而生，因为中药在目前没有被发现很强的耐药性，相比于抗生素中耐药性其危害可以忽略不计，因为中药组方主要调节机制就是改善机体内的新陈代谢，使之调节到平衡稳态，缺点就是没有抗生素效果来的有效和快速。因此，在减少药物残留方面，在速成的肉鸡前期发病可选用疗效快速的西药组方，同时也要注意用药剂量和疗程，合理用药。等病情稳定后再改用中药组方进行疗效巩固，应分开该场保健和常用治疗药物。此外，蛋鸡在生长期可选用西药组方，开产后发病的可选用无抗组方，在最大程度上减少药物的残留问题。

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