牛细小病毒VP2 蛋白单克隆抗体的制备及双抗体夹心ELISA 方法的建立

赵飞鹏，李木子，于晓丽，秦松跃，狄亚心，王一晗，姜艳平，崔 文，乔薪瑗

（东北农业大学动物医学学院，黑龙江 哈尔滨 150030）

牛细小病毒（Bovine parvovirus，BPV）是细小病毒科（Parvoviridae）、细小病毒亚科（Parvovirinae）、牛犬细小病毒属（Bocavirus）的成员。BPV 主要感染母牛生殖器官及犊牛的呼吸器官、消化器官，临床表现为妊娠母牛的流产、死胎，犊牛主要表现为肠炎、腹泻，给养牛业带来严重的经济损失[1-3]。

目前，BPV 检测方法主要有病原分离、电镜、RT-PCR 和免疫荧光法等。病原分离操作难度大，培养技术及条件要求高，检测周期长；电镜技术对病毒浓度及仪器操作技术要求严格；RT-PCR 检测灵敏性高，但特异性稍差。血清学反应是利用抗原与抗体在体外发生的特异性结合反应，通过已知抗体或抗原检测未知抗原或抗体。血清学方法特异性强，且快速简便。双抗体夹心ELISA 是基于免疫酶技术的一种免疫测定方法，通过将已知抗体连接在固相载体上，待测抗原与之结合再与检测抗体、酶标二抗结合。本研究利用BPV VP2 单克隆抗体（MAb）为检测抗体，BPV VP2 多抗作为捕获抗体，建立快速检测BPV 的双抗体夹心ELISA 方法，可为BPV 感染的疫情监测和快速诊断提供技术手段。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料及实验动物大肠杆菌感受态细胞Rosetta 购自北京全式金生物技术有限公司；pProHTa 表达载体购自NEB 公司；BT 细胞、BPV-1 Abnanti 株、牛轮状病毒（BRV）NCDV 株、猪伪狂犬病毒（PRV）JL94 株、猪传染性肠炎病毒（TGEV）LJB-03 株、猪流行性腹泻病毒（PEDV）NJ 株、牛病毒性腹泻病毒（BVDV）BA 株均由本实验室保存；91份健康牛粪便样品取自黑龙江、辽宁、内蒙古3 个地区。6 周龄SPF 级BALB/c 鼠（体重为15 g～20 g）、体重2 kg～3 kg 的健康新西兰兔均购自辽宁长生生物技术有限公司。

1.2 主要试剂病毒DNA 提取试剂盒、DNA 回收试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司；弗氏完全佐剂（FCA）、弗氏不完全佐剂（FIA）、PEG 融合剂、50×HAT、HRP 标记的羊抗鼠IgG（IgG-HRP）、抗体亚类鉴定试剂盒、二甲亚枫（DMSO）均购自Sigma 公司；TMB 显色液购自北京博奥拓达科技有限公司；Protein G 单克隆抗体纯化树脂柱购自GE 公司。

1.3 BPV VP2 基因的克隆及重组质粒的构建根据BPV Abinanti 株VP2 基因全序列（NC_001540.1）设计一对特异性引物，预期扩增片段长度为1 600 bp：P1：5'-CGACCTACAGGACTTTGTGGTGA-3'/P2：5'-GAAA GCTTATGGAGGTATCAAATGATATACCTAAC-3'，引物由吉林库美公司合成。

提取BPV Abinanti 株核酸，利用设计的特异性引物（P1/P2）扩增BPV VP2 基因。PCR 产物经DNA回收试剂盒回收纯化，将其克隆至pMD19-T 载体，鉴定正确后，经双酶切，将目的片段亚克隆至pProHTa 表达载体，转化大肠杆菌Rosetta 感受态细胞，构建重组菌pProHTa-BPV-VP2/Rosetta。

1.4 重组蛋白的表达及纯化重组大肠杆菌pProHTa-BPV-VP2/Rosetta 接种于100 mL 氨苄抗性的LB 培养基中，37 ℃培养至OD600nm值约为1.0 时，加入0.002 mmol/L 的IPTG 诱导4 h。收集菌体，超声破碎，4 ℃离心，取沉淀经western blot 鉴定。鉴定正确的蛋白样品经单克隆抗体纯化树脂柱纯化。

1.5 多克隆抗体的制备将纯化的VP2蛋白与等剂量FCA乳化后，背部多点注射免疫新西兰兔（2.5 kg）。两周后，用纯化的VP2 蛋白与等剂量FIA 乳化，进行第二次免疫。两周后，进行第三次免疫，免疫剂量和方法同第二次免疫。第三次免疫后第7 d，经耳缘静脉采血，收集血清。通过间接ELISA 方法检测血清抗体效价，当血清效价达到1∶12 800 以上时，心脏采血，并收集血清，-80 ℃保存。

1.6 MAb 的制备及鉴定将纯化后的BPV VP2 蛋白免疫BALB/c 鼠（100 μg/只），间隔2 周，免疫3次，并于第3 次免疫后7 d 加强免疫。检测小鼠血清抗体效价达到1∶10 000 以上时，取免疫鼠的脾脏，分离脾细胞，与SP2/0 细胞融合。以表达的BPV VP2重组蛋白为检测抗原，采用间接ELISA 方法对融合的杂交瘤细胞进行筛选。采用有限稀释法对阳性细胞株克隆3 次。通过间接免疫荧光（IFA）对MAb 特异性进行鉴定，以未接毒的BT 细胞作为阴性对照，将接种BPV 36 h 后的BT 细胞用PBS（pH 7.4）洗涤3 次，4%多聚甲醛固定，0.2% Trition-100 穿孔。洗涤3 次后，用0.3% BSA 封闭30 min。洗涤3 次，加入制备的MAb 作为一抗，37 ℃作用1 h，洗涤3次。加入FITC 标记的山羊抗小鼠IgG 作为荧光二抗，37 ℃作用30 min。洗涤3 次后，通过荧光显微镜观察结果。并利用MAb 免疫球蛋白亚类鉴定试剂盒鉴定MAb 亚类，具体步骤参照试剂盒说明书。

1.7 双抗体夹心ELISA 方法的建立

1.7.1 双抗体夹心ELISA 方法最佳反应条件的确定从获得的MAb 中选择一株效价较高的MAb 用于后续实验。以抗BPV MAb 为检测抗体，制备的兔抗VP2多抗为捕获抗体，建立双抗体夹心ELISA 方法。利用方阵法分别对BPV VP2 重组蛋白（2.2 mg/mL）的包被浓度、MAb 稀释度（1∶20～1∶640）、多抗稀释度（1∶100～1∶3 200）、包被条件（37 ℃2 h、37 ℃1 h、37 ℃2 h+4 ℃12 h、37 ℃1 h+4 ℃12 h）、封闭液成分（2% BSA、5% BSA、2%脱脂乳和5%脱脂乳）、封闭时间（37 ℃60 min、37 ℃90 min、37 ℃120 min）和孵育时间（37 ℃60 min、37 ℃90 min、37 ℃120 min、37 ℃150 min）进行优化，以确定最佳反应条件。

1.7.2 双抗体夹心ELISA 方法临界值的确定 采用建立的方法对91 份临床健康牛粪便样品（经PCR 鉴定为阴性）进行检测，测得OD450nm。计算样本OD450nm的平均值（）和标准方差（SD），将OD490nm=+3SD定为样本的阴、阳性的临界值。当样本的OD450nm≥-X+3SD 时，可以在99.9%的水平上判为阳性。反之，当样本的OD450nm＜-X+3SD 时，则判为阴性。

1.7.3 特异性试验 采用建立的双抗体夹心ELISA方法分别对BPV、BRV、PRV、TGEV、PEDV 和BVDV 进行检测，BT 细胞培养物作为阴性对照，分析该方法的特异性。

1.7.4 敏感性试验 将BPV 细胞培养物（TCID50为10-3.06/0.1 mL）分别进行1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256 倍稀释，分析双抗体夹心ELISA 方法对BPV 的最低检出量。

1.7.5 重复性试验 选同一批次包被的酶标板检测5 份BPV-1 Abnanti 株，每批样品做4 个重复孔，同时选4 块不同时间包被的酶标板，检测5 份BPV-1 Abnanti 株，每份样品做4 个重复孔，计算批内和批间检测样品OD450nm值的变异系数（CV），以检验批内和批间样品的重复性。

1.7.6 临床样品的检测 从黑龙江、辽宁和内蒙古3 个地区收集269 份犊牛腹泻病料粪便样品。将收集的样品，用PBS（pH 7.4）缓冲液将其制成悬液，1500 r/min离心10 min 后取上清，分别利用建立的双抗体夹心ELISA 和PCR 方法（P1/P2 引物）进行检测，并比较二者检测结果。

2 结 果

2.1 重组质粒的鉴定及重组蛋白的表达通过PCR扩增获得BPV VP2 基因，将其克隆于pMD19-T 载体中，鉴定为阳性后，将目的片段亚克隆于pProHTa中。构建的重组质粒pProHTa-BPV-VP2经双酶切鉴定，结果显示，酶切条带大小约为6 000 bp和1 600 bp，与预期目的条带大小相符（图1A），且测序结果正确。将重组菌pProHTa-BPV-VP2/Rosetta 扩大培养后诱导表达，表达产物经western blot鉴定，结果显示，表达蛋白大小约为60 ku，与目的蛋白大小相符（图1B），表明VP2 重组蛋白获得表达。

2.2 MAb 的制备及鉴定结果经3 次克隆后获得5株MAb，分别命名为5G9、2B5、6A3、7E8 和2B6。经抗体亚类鉴定，分别为IgG2a、IgG2b、IgM、IgM、IgA。

将5 株MAb 与感染BPV 的BT 细胞作用后，进行IFA 鉴定，结果显示5 株MAb 上清均与BPV 反应，显示特异性荧光，对照组未见特异性荧光（图2）。表明5 株MAb 与BPV 均可发生特异性反应。

图1 重组质粒的酶切鉴定（A）及VP2 重组蛋白表达的western blot 鉴定(B)结果Fig.1 Enzyme digestion of recombinant vector pProHTa-BPV-VP2(A)and identification of VP2 protein expression by western blot(B)

图2 MAb 的IFA 鉴 定 结 果Fig.2 Identification of MAbs by indirect immunofluorescence assay

2.3 双抗体夹心ELISA 方法的建立

2.3.1 最佳反应条件的确定 选择效价较高的MAb 2B5 用于建立双抗体夹心ELISA 方法。反应条件经优化后，确定BPV VP2 蛋白最佳包被浓度为0.9 μg/mL，最佳包被条件、封闭液成分、封闭时间和孵育时间见表1。

表1 最佳反应条件优化结果Table 1 Optimization of working conditions

2.3.2 临界值的确定 利用建立的双抗体夹心ELISA 方法对91 份阴性样品进行检测，根据测得的OD450nm值经计算，OD450nm平均值=0.091 833，标准差=0.003 430，+3SD=0.102 124，即当样品OD450nm值≥0.102 124 时，判为阳性。

2.3.3 特异性试验结果 采用建立的双抗体夹心ELISA 方法分别检测BPV、BRV、PRV、TGEV、PEDV 和BVDV，结果显示该方法仅对BPV 检测为阳性，而对其它病毒检测为阴性（图3）。表明所建立的方法具有较强的特异性。

图3 特异性试验结果Fig.3 Results of spectificity experiment

2.3.4 敏感性试验结果 将BPV 细胞培养物2 倍倍比稀释后，对建立方法的敏感性进行分析，结果显示，当BPV 细胞培养物稀释倍数为1∶32 时，检测结果仍为阳性，即所建方法对BPV 的最低检出量为3.125×102.8TCID50/mL（图4）。表明所建立的方法具有较高的敏感性。

图4 敏感性试验结果Fig.4 Results of sensitivity experiment

2.3.5 重复性试验结果 采用建立的双抗体夹心ELISA 方法进行批内和批间重复性试验，结果显示，批内和批间重复性试验的变异系数均小于10%（表2），表明建立的双抗体夹心ELISA 法具有良好的重复性。

表2 重复性试验结果Table 2 Results of intra-and inter-batches test

2.4 临床样品的检测通过PCR 方法和本研究建立的双抗体夹心ELISA 方法对269 份临床腹泻粪便样品进行检测，并将结果进行对比，双抗体夹心ELISA 方法及PCR 方法均检出完全相同的14 份阳性样品，两种方法检测符合率为100%。表明所建立的双抗体夹心ELISA 方法可以用于BPV 临床血清学监测。

3 讨 论

BPV 感染的主要症状是急性肠胃炎，回肠和空肠黏膜出现不同程度充血、出血或溃疡，严重者排出血便；怀孕母牛感染BPV 后表现为生殖机能障碍、流产，严重可引起死胎[4-6]。BPV 感染的初期症状不明显，所以BPV 感染早期不易被发现。且牛细小病毒病是一种接触性疾病，主要经空气传播，导致该病防控比较困难，对畜牧业危害较大。因此，建立有效的快速检测方法对该病的早期诊断及防控均具有重要意义。

BPV 有3 种结构蛋白（VP1、VP2、VP3），VP2 是病毒重要的衣壳蛋白，保守性高，且在病毒中含量高，适合用作检测抗原[7]。研究表明，原核表达的VP2 蛋白具有与病毒天然蛋白相似的免疫活性，可用于制备BPV 检测方法的诊断试剂[8]。因此，无论作为BPV 诊断抗原，还是用于抗体制备及疫苗研制方面，同其他蛋白相比，VP2 蛋白具有更大的优势。在本研究中，以VP2 作为免疫原，筛选了具有高亲和力的MAb，可与天然BPV 发生特异性反应，可用作BPV 检测的诊断试剂，为临床诊断奠定基础。

本研究利用免抗BPV VP2 多抗作为捕获抗体，BPV VP2 MAb 作为检测抗体，建立了双抗体夹心ELISA 方法。反应中抗原与两种抗体不同抗原决定簇结合，大大提高了检测的特异性和敏感性，检测结果可信度更高。该检测方法中待检样品不需要进行病毒富集和特殊处理即可直接用于检测。同时，阴性对照和阳性对照的设置保证了每次重复试验的准确性。大量样品检测均处于同一反应体系中，操作步骤相同，可将操作过程中的误差降到最低。此外，双抗体夹心ELISA 方法的操作步骤简单，耗费时间短，对于试验人员的专业要求相对较低。且用于双抗体夹心ELISA 方法的试剂非常普遍，价格便宜，使得双抗体夹心ELISA 方法更具有普适性，可用于大批量样品的检测。与传统方法相比，更具优势，更适合在临床检测中推广[9-12]。

综上，本研究建立的双抗体夹心ELISA 方法特异性强、敏感性高、重复性好，可用于BPV 早期感染的诊断，为BPV 感染疾病的防控提供了一种快速检测方法和监测手段。