白藜芦醇改善妊娠期糖尿病大鼠及子代糖耐量和胰岛功能

邵锦华， 邵 娟， 汪 宁， 孙 瑾

（1.西安市第五医院陕西省中西医结合医院老年病科，西安 710000； 2.西安市第五医院妇产科，西安 710082； 3.西安交通大学第一附属医院老年病科，西安 710000； 4.西安市第五医院风湿免疫科，西安 710000）

妊娠期糖尿病（gestational diabetes mellitus，GDM）指妊娠晚期首次发病的高血糖症[1]。其特征主要是胰岛素抵抗、高胰岛素血症、糖耐量减低、高血糖、妊娠体质量异常增加以及分娩期间并发症风险增加[2]。既往诊断妊娠期糖尿病能增加孕妇患高血压、肥胖和心血管疾病的风险[3]。此外，妊娠期糖尿病子代更容易发生肥胖、糖尿病和心血管疾病[4]。因此，减缓和控制妊娠期糖尿病的发展至关重要。

治疗上，首选生活方式的改变（如运动和饮食控制），其次是药物治疗（如胰岛素、格列本脲和二甲双胍）[5]。然而，药物疗法常常伴随不良结果，如孕产妇低血糖和巨大胎儿等。因此，寻找新疗法预防GDM尤为重要。白藜芦醇（RESV）具有强大的抗氧化、抗炎和抗凋亡作用[6]。有研究[7-8]表明，RESV可改善产妇子宫动脉血流，减少妊娠期体质量和增加胰岛素敏感性，其作用途径与运动和卡路里限制相似。因此，其作为辅助治疗具有潜在的实用价值。但RESV是否可以用于GDM的治疗及母亲补充RESV对子代的糖耐量和胰岛功能是否有影响尚不清楚。因此，本文对饮食诱导的GDM大鼠模型补充RESV，以探究对子代的糖耐量和胰岛功能的改善作用。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器

RESV和胶原酶V购自美国Sigma公司。RPMI-1640培养基和10%胎牛血清购自美国康宁公司。大鼠胰岛素ELISA试剂盒和大鼠胰高血糖素放射免疫试剂盒购自美国密理博公司。低脂饲料和高脂饲料购自美国Research Diet公司。卓越快速血糖仪购自美国罗氏公司，NanoDropTM 2000分光光度计购自美国Thermo公司，共聚焦显微镜购自美国Leica公司。

1.2 实验动物分组及模型制备

3周龄健康雌性SD大鼠购自北京维通利华实验动物技术公司，采用饮食诱导肥胖的大鼠模型进行研究。对照组（n=6）大鼠给予低脂饮食（10%kcal脂肪），GDM 大鼠（n=12）给予高糖高脂饮食（45%kcal脂肪）持续8周以诱导肥胖，随后雌鼠与喂食对照饲料的雄鼠交配。检测妊娠中末期血糖浓度，血糖＞7.8 mmol·L-1代表造模成功。GDM大鼠随机分为GDM组及GDM+RESV干预组，每组6只，从妊娠第14天开始，给予添加 RESV 的高脂饮食［4 g·（kg·d）-1］，并持续整个哺乳期。为避免食物争夺，每窝幼鼠数量被控制在8只。3周哺乳期结束后，随机分配雄性和雌性子鼠，给予12周的低脂或高脂饮食，每周记录进食量和体质量。15周龄时，检测子鼠的糖耐量水平和胰岛素功能。

1.3 葡萄糖耐受实验

在母鼠孕晚期（妊娠18.5 d）和子鼠15周时分别进行葡萄糖糖耐量试验，测试前，所有大鼠禁食12 h。每只大鼠腹腔注射2 g·kg-1浓度为20%的葡萄糖溶液，分别在 0、30、60、90、120 min 时，尾静脉检测并记录血糖。

1.4 分离大鼠胰岛

子代喂养至20周时，腹腔注射10%水合氯醛1.5～2 mL麻醉大鼠后，采用经胆总管插管注入胶原酶V的方法对母代大鼠胰腺进行消化后钝性分离摘取胰腺，将胰腺置于胶原酶V中37℃水浴消化15 min，每2～3 min手动振摇。消化后，加入RPMI-1640培养基+10%胎牛血清+1%L-谷氨酰胺纯化胰岛，2000×g，4℃水平离心 20 min。弃去上清液，用PBS液重悬。解剖显微镜下分离胰岛，随后置于RPMI-1640培养基中37℃、5%CO2孵育过夜。

1.5 胰岛激素检测

体外培养的胰岛给予16.7 mmol·L-1葡萄糖刺激30 min。按照说明书操作，用大鼠胰岛素ELISA试剂盒测定胰岛素浓度，用放射免疫试剂盒检测胰高血糖素的分泌。通过酸-醇体外提取胰岛中总胰岛素和胰高血糖素，水中重悬后分别用上述试剂盒测定，数据用DNA总量进行归一化，采用NanoDropTM 2000分光光度计定量分析。每组实验独立重复3次。计算各组胰岛素抵抗指数稳态模型（HOMA-IR），计算公式：HOMA-IR=空腹血糖水平（FPG）×空腹胰岛素水平（FINS）/22.5。

1.6 免疫荧光染色

取大鼠胰岛组织，固定，按照冰冻切片常规步骤进行制片，然后采用大鼠免疫荧光染色试剂盒观察体外培养的胰岛中胰岛素的表达，在玻片上滴加荧光抗体染液，加盖37℃孵育30 min，PBS冲洗3次，蒸馏水冲洗后封片，共聚焦显微镜拍摄图像。每组实验至少重复3次。

1.7 统计学方法

采用Prism 7.0（美国GraphPad公司）统计软件对数据进行分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，两组比较采用t检验，多组比较采用单因素方差分析（One-Way ANOVA）。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组母鼠进食量和体质量变化

对照组、GDM组和GDM+RESV组母鼠整个孕期摄入能量差异均无统计学意义（P均＞0.05）。与对照组比较，而GDM组、GDM+RESV组母鼠的进食量降低，体质量增加（P均＜0.05），与GDM组比较，GDM+RESV组母鼠体质量下降（P＜0.05）。见表1。

表1 各组母鼠进食量和体质量变化（±s）

表1 各组母鼠进食量和体质量变化（±s）

与对照组比较*P＜0.05；与GDM组比较#P＜0.05。

组别 进食量/g 摄入能量/kcal 体质量/g对照组 48.2±1.2 179.8±32.1 306.8±9.5 GDM 组 40.2±1.7* 182.4±33.2 486.2±12.5*GDM+RESV 组 38.8±1.5* 175.2±34.0 438.8±10.0*#F值 70.359 0.073 448.962 P值 ＜0.001 0.930 ＜0.001

2.2 各组子鼠进食量和体质量变化

三组低脂和高脂饮食子鼠进食量及摄入能量比较差异均无统计学意义（P均＞0.05）；三组低脂饮食子鼠体质量差异无统计学意义（P＞0.05），而三组高脂饮食子鼠体质量均较低脂饮食子鼠增加（P均＜0.05），且与对照组高脂饮食子鼠相比，GDM组和GDM+RESV组高脂饮食子鼠体质量增加，GDM+RESV组高脂饮食子鼠较GDM组高脂饮食子鼠体质量降低（P均＜0.05）。见表2。

2.3 RESV对妊娠晚期母鼠糖耐量的影响

GDM组妊娠晚期母鼠的血糖浓度与糖耐量水平高于对照组（P＜0.05），而GDM+RESV组母鼠的血糖浓度与糖耐量水平低于GDM组（P＜0.05）。见图1。

2.4 RESV对妊娠晚期母鼠胰岛功能的作用

与对照组母鼠相比，GDM组、GDM+RESV组母鼠血浆胰岛素浓度降低，且HOMA-IR下降（P均＜0.05）。与对照组母鼠相比，GDM+RESV组母鼠血浆胰岛素浓度和HOMA-IR指数升高（P均＜0.05）。与对照组相比，GDM组母鼠离体胰岛素分泌量以及离体总胰岛素含量降低，而GDM+RESV组母鼠离体胰岛素含量增加，离体总胰岛素含量降低（P均＜0.05）；GDM+RESV组离体胰岛素分泌量和离体总胰岛素含量均较GDM组升高（P均＜0.05）。见表3。

表2 各组子鼠进食量和体质量变化（±s）

表2 各组子鼠进食量和体质量变化（±s）

与对照组高脂饮食子鼠比较*P＜0.05；与GDM组高脂饮食子鼠比较#P＜0.05；与GDM组低脂饮食子鼠比较&P＜0.05；与GDM+RESV组低脂饮食子鼠比较$P＜0.05。

母鼠 子鼠进食量/g 摄入能量/k c a l 体质量/g对照组 低脂饮食 4 6.6±2.8 1 9 1.5±1 0.1 3 5 0.2±1 2.0*高脂饮食 4 2.6±3.9 2 0 0.1±1 9.0 3 8 0.6±2 1.1#$G D M组 低脂饮食 4 8.1±3.0 1 9 3.6±9.1 3 6 5.5±1 2.8高脂饮食 4 6.1±5.9 2 0 5.6±3 8.2 4 5 8.2±3 0.8*&G D M+R E S V组 低脂饮食 4 6.7±2.6 1 9 1.3±1 2.8 3 5 5.9±1 8.4高脂饮食 4 4.5±2.7 2 0 3.2±1 5.2 3 9 8.0±1 6.8*#$F值 — 1.7 9 1 0.4 9 5 3 1.9 9 1 P值 — 0.1 6 2 0.7 9 3 ＜0.0 0 1

2.5 母鼠补充RESV对高脂饮食子鼠糖耐量的作用

GDM组子鼠的血糖浓度与糖耐量水平高于对照组子鼠（P＜0.05），而GDM+RESV组子鼠的血糖浓度与糖耐量水平低于GDM组子鼠（P＜0.05）。见图2。

2.6 母鼠补充RESV对高脂饮食子鼠胰岛功能的作用

GDM组子鼠的血浆胰岛素浓度、离体胰高血糖素分泌量以及离体总胰高血糖素含量均降低，离体胰岛素分泌量高于对照组子鼠（P均＜0.05），GDM+RESV组血浆胰岛素浓度、离体胰高血糖素分泌量、离体胰岛素分泌量高于对照组子鼠（P均＜0.05）；GDM+RESV组血浆胰岛素浓度、离体胰高血糖素分泌量、离体总胰岛素含量高于GDM组，离体胰岛素分泌量低于GDM组（P均＜0.05）。见表4。免疫荧光检测显示，与对照组相比，GDM组胰岛素水平减弱，而GDM+RESV组子鼠的胰岛素水平升高。见图3。

表3 RESV对妊娠晚期母鼠胰岛功能的作用

表4 母鼠补充RESV对高脂饮食子鼠胰岛功能的作用（±s）

表4 母鼠补充RESV对高脂饮食子鼠胰岛功能的作用（±s）

与对照组比较*P＜0.05；与GDM组比较#P＜0.05。

组别 血浆胰岛素浓度/（n g·m L-1）离体总胰高血糖素含量/（n g·μ g-1）对照组 5.8 8±0.7 0 0.7 5±0.1 1 0.7 2±0.1 4 3 2.8 7±2.2 2 7.4 1±0.5 0 G D M 组 5.0 1±0.6 3* 3.2 8±0.2 0* 0.3 7±0.0 8* 3 2.0 8±1.9 9 4.2 2±0.3 8*G D M+R E S V 组 7.8 4±0.8 5*# 2.1 8±0.1 5*# 1.0 7±0.2 5*# 3 5.5 9±2.7 0# 4.3 5±0.2 7 F值 2 5.5 0 1 3 8 8.3 0 3 2 4.9 1 5 3.7 7 2 1 2 5.5 5 1 P 值 ＜0.0 0 1 ＜0.0 0 1 ＜0.0 0 1 0.0 4 7 ＜0.0 0 1离体胰岛素分泌量/（n g·μ g-1）离体胰高血糖素分泌量/（n g·μ g-1）离体总胰岛素含量/（n g·μ g-1）

3 讨论

肥胖和2型糖尿病在孕妇中发病率极高，据报道，育龄妇女超重和肥胖率逐年增加[9]。此趋势导致GDM发病率不断上升，不仅严重威胁了孕产妇的身心健康，同时还增加了其子代成年后发生肥胖、2型糖尿病以及其他心脑血管疾病的风险[10]。因此，找到安全有效控制孕妇GDM的方法迫在眉睫。本研究中探讨RESV作为GDM治疗策略的作用，以及其对子代成年后糖耐量和胰岛功能的长期影响，以期为治疗和预防GDM提供新靶点和新思路。

尽管生活方式的干预仍是目前治疗GDM的首选方案，但由于患者依从性较差且缺乏孕期运动强度和频率的标准，其效果往往十分有限。因此，可发挥与运动或者能量限制类似作用的天然产物如RESV，在治疗GDM以及控制其并发症方面有着巨大前景[11]。以往关于RESV对GDM的研究，多集中于采用链脲霉素诱导的1型糖尿病动物模型，且多针对仅在孕早期或者整个孕期和哺乳期补充RESV[12-13]。本研究在孕晚期发现GDM时，给予RESV治疗可改善GDM大鼠葡萄糖耐受不良、降低血糖水平、提高胰岛素分泌和胰岛功能；此外，给母鼠补充RESV可预防其子鼠肥胖，同时改善子鼠葡萄糖刺激的胰岛素分泌，从而可能延缓其代谢性疾病的发生。本研究与前期利用RESV进行预防研究形成对比，首次观察RESV在孕晚期作为治疗药物对GDM母鼠及其子代糖耐量和胰岛功能的作用。尽管RESV口服生物利用度较低，但是当其作用于母体时，可透过胎盘屏障作用于胎儿[14]，因此，有必要关注RESV对胚胎发育的影响。有研究[15]报道，孕期大鼠补充RESV对胎儿体质量和发育无明显作用；链脲霉素诱导的1型糖尿病大鼠其子代出生体质量下降，孕期补充RESV可使其子鼠体质量恢复正常。若GDM大鼠血糖未得到有效控制，巨大儿的风险提高。本研究中显示，给予高脂饮食，RESV治疗的GDM母鼠，其子鼠体质量高于对照组，提示具有降糖作用的RESV，可作为GDM的候选治疗药物。有研究[16]报道，患GDM的女性，其子代在成年后胰岛β细胞功能受损。本研究表明，与对照组母鼠的子鼠相比，GDM母鼠的子鼠血浆胰岛素浓度、离体胰高血糖素分泌量以及离体总胰高血糖素含量均降低，离体胰岛素分泌量增加，说明GDM母鼠的子鼠给予高脂饮食后，其胰岛分泌胰岛素和胰高血糖素受损，因此GDM母鼠的子鼠血浆及离体胰岛素和胰高血糖素分泌量均异常，而通过RESV干预母鼠，可改善其子鼠高脂饮食状态下的胰岛功能。

综上所述，孕晚期补充RESV可改善GDM母鼠及其子鼠的糖耐量水平和胰岛功能，提示其可作为GDM的候选药物进行进一步研究。然而，本研究尚存在一定的局限性。例如，本研究未能检测母鼠和子鼠的RESV血药浓度。此外，孕期激素水平的变化是否与RESV发挥的改善糖耐量和胰岛功能的作用有关，尚待进一步研究证实。