黄连解毒汤对人胃癌SGC-803细胞株作用的实验研究

高东霞　盖广东　张士刚　李加庆　孙付军　桑晓光　殷晓敏　孙通华

【摘 要】 目的：觀察黄连解毒汤对人胃癌细胞株SGC-803的作用及其机制。方法：体外培养胃癌细胞株SGC-803，应用黄连解毒汤干预胃癌SGC-803细胞。运用CCK-8实验检测SGC-803细胞增殖;划痕实验检测细胞迁移能力;流式细胞仪检测细胞凋亡水平;qRT-PCR法检测细胞相关基因mRNA的表达水平。结果：CCK-8实验结果表明，黄连解毒汤可有效抑制胃癌MGC-803细胞株的增殖，且呈现出药物浓度依赖性及时间依赖性。划痕实验结果表明，黄连解毒汤干预的实验组细胞迁移率的增长明显慢于对照组，具有统计学差异（P<0.05）。流式细胞术检测细胞凋亡结果显示，黄连解毒汤可以有效促进胃癌细胞的凋亡，实验组MGC-803细胞的细胞凋亡率与对照组相比均有显著性差异（P<0.05）。qRT-PCR结果显示，经黄连解毒汤干预，Bax、Caspase3基因mRNA表达上调，Bcl-2基因mRNA表达下调。结论：黄连解毒汤能够通过诱导SGC-803抑制胃癌细胞MGC-803增殖，抑制胃癌细胞迁移能力，推测其机制可能是通过影响凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax的表达，发挥抗肿瘤作用。

【关键词】 黄连解毒汤;SGC-803;细胞凋亡

【中图分类号】R285.5   【文献标志码】 A    【文章编号】1007-8517（2020）18-0017-04

Experimental Study on the Effect of Huanglianjiedu Decoction on SGC-803

GAO Dongxia1 GAI Guangdong1 ZHANG Shigang2 LI Jiaqing3 SUN Fujun4 SANG Xiaoguang5* YIN Xiaomin5 SUN Tonghua5

1.Yinan  Maternal and Child Health Hospital，Shandong Province，Yinan 276300，China;

2.Taian  traditional Chinese Medicine Hospital，  Shandong Province， Taian 271000，China;

3.Yinan  peoples Hospital，  Shandong Province， Yinan 2763004，China;

Shandong Institute of traditional Chinese Medicine， Shandong Province， Jinan  250014，China;

5.Shouguang peoples Hospital，  Shandong Province， Shouguang 262700，China

Abstract：Objective To observe the effect of Huanglianjiedu Decoction on SGC-803 and its mechanism. Methods SGC-803 was cultured in vitro， and SGC-803 were interfered with Huanglianjiedu Decoction with different concentrations. CCK-8 experiment was used to detect the proliferation of SGC-803; scratch test was used to detect the cell migration ability; flow cytometry was used to detect the apoptosis level; qRT-PCR method was used to detect the cell-related gene mRNA expression level. Results The results of the CCK-8 experiment showed that Huanglianjiedu Decoction can effectively inhibit the proliferation of MGC-803， and showed drug concentration and time dependence. The results of scratch experiments showed that Huanglianjiedu Decoction interfered with the cells in the experimental group. The increase of migration rate was significantly slower than that of the control group， with a statistical difference （P<0.05）. Apoptosis detected by flow cytometry showed that Huanglian jiedu Decoction can effectively promote the apoptosis of gastric cancer cells. Compared with the control group， the apoptosis rate was significantly different （P<0.05）; qRT-PCR results showed that with the intervention of Huanglianjiedu Decoction， the mRNA expression of Bax and Caspase3 was up-regulated， and the mRNA expression of Bcl-2 was down-regulated. Conclusion Huanglianjiedu Decoction can inhibit the proliferation of MGC-803 by inducing SGC-803 and inhibit the migration ability of gastric cancer cells. It is speculated that the mechanism may be to exert anti-tumor effects by affecting the expression of apoptosis-related proteins Bcl-2 and Bax.

Keywords：Huanglianjiedu Decoction;SGC-803;Apoptosis

胃癌（Gastric Carcinoma， GC）是最常见的消化道系统肿瘤，目前仍是影響全球的一大健康问题，其发病率在肿瘤中高居第五，死亡率高居第三[1]。在我国胃癌发病率也一直居高不下。尽管早期胃癌患者可通过手术治疗，然而胃癌的复发，转移及耐药等问题仍然令人堪忧。中药因其表现出增效减毒作用，是治疗恶性肿瘤中的重要组成部分，因此，寻找一种能够提高治疗胃癌疗效的中药具有重要的意义。

黄连解毒汤由黄连、黄芩、黄柏、栀子组成，是常用清热解毒代表方剂之一，可泻火解毒、凉血止血。现代报道该方含有小檗碱、黄芩素等[2]抗肿瘤活性成分，有明显抑制恶性肿瘤的作用[3]。近年来已有研究把黄连解毒汤用于肿瘤治疗，动物实验证实[4-5]，黄连解毒汤对小鼠体内、体外肿瘤生长均有抑制作用。现为进一步研究黄连解毒汤抗肿瘤疗效，本实验采用体外培养技术，以人胃癌细胞SGC-803模型，探究黄连解毒汤抑制其增殖、迁移及凋亡情况，为黄连解毒汤治疗胃癌的临床应用提供依据。

1 材料

1.1 药物 黄连解毒汤由黄连、黄芩、黄柏、栀子按原方比例（3∶2∶2∶3）配制而成。将全部药物混合，浸泡，煎煮，二煎后均匀混合，置于蒸发仪上，浓缩为1.4 g/mL的黄连解毒汤;药液1200 rpm离心两次后取上清，置于微量离心管，1300 rpm5 min超速离心一次;集上清，0.22 μm 微孔滤膜过滤除菌后于-20 ℃冰箱保存备用。

1.2 细胞株 SGC-803 胃癌细胞株（购于南京凯基生物科技发展有限公司）。

1.3 试剂 胎牛血清（杭州天杭生物科技公司公司）;RPMI-1640 液体培养基（含10%FBS，青霉素100U/L，链霉素100U/L，赛默飞世尔科技公司）;CCK-8试剂盒（亚科因生物技术公司）;AnnexinV/FITC 试剂盒及线粒体膜电位试剂盒（贝博生物公司）;Bcl-2、Bax、Caspase3 等购自武汉三鹰生物技术公司。

2 方法

2.1 细胞培养 选用10%胎牛血清的RPMI-1640培养基进行人胃癌MGC-803细胞培养。在37 ℃、5%CO2的细胞培养箱中培养，每2～3 d传代一次，细胞呈单层贴壁生长，在细胞达到指数增长期时开展实验，制成单细胞悬液，按所需浓度接种使用。

2.2 CCK-8实验检测细胞增殖抑制率 实验共分3组：空白组;对照组：培养基（90%RPMI1640+10%FBS）;实验组：设0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%五个不同中药浓度（用培养基配制）。CCK-8增殖检测试剂盒测定细胞活力，取对数生长期MGC-803细胞制备细胞混悬液;调整细胞浓度为5×104/mL，进行细胞计数;接种于96孔板，每孔加培养液100 μL，每孔细胞数为5000个，每组设平行6个复孔，共铺3块96孔板;按设计对不同实验组细胞进行加药，于培养箱中按不同时间段分别培养24 h、48 h、72 h，检测时吸出相应的96孔板内液体，反应液取CCK-8和培养基以1∶[KG-*2]9的比例配置，每孔加入100 μL，继续培养2 h;[JP3]置于全自动酶标仪中，设定参数（波长490 nm、中等强度震荡10 min），检测各孔的OD值。实验重复3次，并记录结果。抑制率（%）=[1-（实验组OD值-空白组OD值）/（对照组OD值-空白组OD值）]×100%。

2.3 划痕实验检测细胞迁移率 对照组：RPMI-1640;实验组：黄连解毒汤（浓度：MGC-803细胞用RPMI-1640配制）。调整细胞浓度为1.5×105/mL为细胞计数;将细胞接种于6孔板，每孔2mL;待细胞密度至70%～80%时，用100μL规格枪头划痕;PBS轻柔洗涤2次，去除漂浮细胞;显微镜拍照记录初始划痕范围;按设计对不同实验组细胞进行加药，继续培养;24h、48h后，再次拍照记录细胞划痕范围，计算细胞迁移率。细胞迁移率=迀移距离/划痕宽度×100%

2.4 流式细胞术检测细胞凋亡率 对照组：培养基（90%RPMI1640+10%FBS）;实验组：黄连解毒汤水提物（浓度：MGC-803细胞，用培养基配制）。在含90%RPMI1640+10%FBS的培养液中常规培养细胞，消化细胞，离心5 min，弃上清，收集细胞;用培养基重悬细胞，计数细胞，调整细胞浓度为1.5×105/mL，接种于细胞培养皿中培养细胞，使细胞贴壁，培养至细胞基本覆盖培养皿底部。加入黄连解毒汤的培养液，继续培养。48 h后从培养箱中取出，收集细胞培养液，冷PBS洗涤细胞2次，消化，收集所有细胞。离心，再用PBS洗细胞2次，吸弃PBS。加入400 μL×Binding Buffer缓冲液重悬细胞;将细胞转移至流式管中;加入 Annexin V-FITC和5 μL PI，在避光处轻轻混匀，孵育细胞15 min;1 h内用流式细胞仪检测，记录实验结果。

2.5 qRT-PCR检测细胞相关基因mRNA的表达 对照组：培养基（90%RPMI1640+10%FBS）;实验组：黄连解毒汤（浓度：MGC-803细胞，用培养基配制）。收集黄连解毒汤水提物处理过的MGC-803细胞总RNA，以其反转录合成的cDNA为模板，β-actin为内参进行qRT-PCR 检测，每组实验重复三次。得到的数据采用2–ΔΔCt计算获得细胞中Bcl-2、Bax、Caspase3 mRNA 的相对表达量。利用PrimerPremier5.0软件设计引物，β-actin上游引物为5′-AACAAGATGAGATTGGCA-3′，下游引物为5′-AGTGGGGTGGCTTTTAGGAT-3′;Bcl-2上游引物为5′-CGACTTCGCCGAGATGTCCA-3′，下游引物为 5′-TTGACTTCACTTGTGGCCCA-3′;Bax上游引物为 5′-ATGATTGCCGCCGTGGACAC-3′，下游引物为 5′-CCACCCTGGTCTTGGATCCA-3′;Caspase3上游引物为 5′-CATGGAAGCGAATCAATGGACT-3′，下游引物为 5′-CTGTACCAGACCGAGATGTCA -3′。增反应程序结束后，以2–ΔΔCt方法计算目的基因mRNA相对表达量。

2.6 统计学方法 统计分析应用SPSS 25.0软件包进行统计学处理数据，数据以（x±s）表示，组间比较采用检验χ2检验，P<0.05表示有统计学意义。

3 结果

3.1 黃连解毒汤不同浓度、时间对MGC-803细胞増殖的抑制率 由表1可知，随着黄连解毒汤用药浓度及用药时间的增加，胃癌MGC-803细胞增殖水平被逐渐抑制，呈现时间及浓度依赖性，与对照组、空白组比较具有显著差异（P<0.01）。

3.2 黄连解毒汤对MGC-803细胞迁移的影响 由表2可知，在同一作用时间，黄连解毒汤干预的实验组MGC-803细胞的迁移率较对照组显著下降（P<0.01），提示黄连解毒汤对胃癌MGC-803细胞迁移能力明显抑制。

3.3 黄连解毒汤不同浓度、时间对MGC-803细胞凋亡的影响 由表3可知，流式细胞术检测细胞凋亡结果显示，同一作用时间，不同浓度黄连解毒汤干预下MGC-803细胞的细胞凋亡率均高于对照组（P<0.01）。

3.4 黄连解毒汤对胃癌细胞相关基因mRNA表达的影响 由表4可知，qRT-PCR结果显示，经黄连解毒汤干预后Bax、Caspase3 基因mRNA表达上调，Bcl-2基因mRNA表达下调，与对照组相比，差异具有统计学意义（P<0.05）。

5 讨论

黄连解毒汤，君以黄连入上焦而清心除烦、入中焦而祛湿热之邪;臣以黄芩、黄柏相伍，黄芩以攻中上焦湿热，黄柏以走下焦而除湿热诸证;佐以栀子通泻三焦湿热，引火下行，四药相辅相成，共奏泻火解毒、治疗三焦火毒之效。中医学认为，肿瘤其证多属本虚标实，胃为仓廪之官，受纳腐熟水谷，脾胃运化失司，湿热蕴结，气血热毒瘀滞，胃络被热毒所伤而致血败肉腐，发生病变。黄连解毒汤以清热解毒为法，清解蕴结之热毒，是治疗胃癌的主要治法之一。本实验采用经典的黄连解毒汤干预胃癌MGC-803细胞，该方被证实具有抗肿瘤作用，其有效成分小檗碱、黄芩素等抗肿瘤活性成分，有明显抑制恶性肿瘤的作用，可通过抑制肿瘤细胞分裂，从而抑制其增殖[3]。

研究以人胃癌MGC-803细胞作为研究对象，对黄连解毒汤的抗癌作用及机制进行了相关探索。实验结果表明，随着黄连解毒汤的浓度及用药时间的增加，MGC-803细胞增殖水平被逐渐抑制，且呈现出药物浓度及时间依赖性;在药物作用24h、48h时，MGC-803细胞的早期、晚期凋亡率均有升高，随给药浓度的增高，凋亡率明显上升，由此可见，黄连解毒汤可以有效促进胃癌细胞的凋亡，且可能主要作用于早期凋亡，并呈一定浓度相关性。细胞的增殖与凋亡始终保持动态平衡，可维持细胞群体数量的稳定，当动态平衡被打破，细胞凋亡失常，成为肿瘤形成的重要病理基础之一，参与肿瘤的发生发展过程。认为黄连解毒汤通过抑制胃癌MGC-803细胞增殖，诱导其凋亡，是黄连解毒汤方降低胃癌患者复发率及转移率的重要途径之一。经黄连解毒汤干预后Bax、Caspase3 基因mRNA表达上调，Bcl-2基因mRNA表达下调。报道证实[6]Bax和Bcl-2是Bcl-2蛋白家族成员之一，与细胞凋亡和肿瘤发生发展有关。这与本次研究结果相符，黄连解毒汤可诱导MGC-803凋亡相关蛋白表达水平发生改变，Bcl-2表达量下降，Bax表达量上升，Bcl-2/Bax比值下降。此外，有研究表明，Bcl-2/Bax在线粒体中定位决定凋亡的发生，其比值与凋亡水平有关[7]。以上研究结果表明，黄连解毒汤诱导胃癌细胞MGC-803凋亡，可能是通过线粒体途径。本实验揭示了黄连解毒汤抗胃癌侵袭的作用机制，为开发新型抗胃癌药提供了中药的理论依据，更好的将基础医学研究成果应用至临床工作中，从而建立最有效的治疗手段。

综上所述，黄连解毒汤能够通过诱导细胞凋亡抑制胃癌细胞MGC-803增殖，并且还抑制胃癌细胞迁移能力。此外，还可能通过影响凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax的表达，从而发挥抗肿瘤作用。然而，细胞信号通路极其复杂，对胃癌细胞作用是否还影响信号通路及存在更多的潜在作用机制，目前仍不清楚。尽管如此，研究结果证实了黄连解毒汤具有明显抗肿瘤作用，可能会是治疗胃癌一种新的治疗策略，为临床胃癌治疗提供了实验依据。

参考文献

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[7]SANTOS L C，VOGEL R，CHIPUK J E，et al.Mitochondral origins of fractional control in regulated cell death[J].Nat Commun，2019，10（1）：1313.

（收稿日期：2020-05-02 编辑：刘斌）

基金项目：2020年潍坊市中医药科技项目（2020-4-117）。

作者简介：高东霞（1977- ），女，汉族，本科，主治医师，研究方向为中西医结合防治肿瘤及妇产科疾病。E-mail：gdx529@126.com

通信作者：桑晓光（1980- ），男，汉族，硕士，主治医师，研究方向为消化系统疾病的基础与临床。E-mail：sangxg2013@163.com