蒙药材多叶棘豆和硬毛棘豆对比研究

杨立国　新红　陈香梅　达拉胡　苏都那布其　王秀兰

【摘 要】 目的：探讨多叶棘豆和硬毛棘豆临床混用的合理性。方法：文章拟以多叶棘豆和硬毛棘豆为研究对象，从显微特征、薄层色谱、HPLC特征图谱和总黄酮含量等方面对多叶棘豆和硬毛棘豆进行对比研究，以期为多叶棘豆和硬毛棘豆的合理应用提供参考。结果：多叶棘豆和硬毛棘豆在化学成分方面存在着不小的差别。结论：建议临床医生谨慎混用多叶棘豆和硬毛棘豆。

【关键词】 棘豆属;显微特征;薄层色谱;HPLC特征图谱;总黄酮

【中图分类号】R282.5   【文献标志码】 A    【文章编号】1007-8517（2020）18-0062-04

Comparative study of Oxytropis myriophylla and Oxytropis hirta

YANG Liguo1，2 XIN Hong2 CHEN Xiangmei1 Dalahu3 Sudunabuqi2 WANG Xiulan1，2

1. College of Mongolian Medicine and Pharmacy， Inner Mongolia University for Nationalities， Tongliao 028000，China;

2. Mongolian Medicine Engineering Technology Institute of Inner Mongolia， Tongliao 028000，China;

3.Kulun Mongolian Hospital， Tongliao 028000，China

Abstract：Objective To explore the rationality of clinical mixed use of Oxytropis myriophylla and Oxytropis hirta. Methods This paper conducts a comparative study on the difference in microscopic characteristics， TLC， HPLC fingerprints and the content of total flavonoids between Oxytropis myriophylla and Oxytropis hirta， and provides the references for further studies. Results There is a big difference in chemical constituents between Oxytropis myriophylla and Oxytropis hirta. Conclusion It is suggested that clinicians should not replace each other when using Oxytropis myriophylla and Oxytropis hirta.

Keywords：Oxytropis; Microscopic Characteristics; TLC; HPLC Fingerprints; Total Flavonoids

棘豆屬植物全世界约300余种，主要分布在北半球，我国约150余种，分布在东北、华北、西北等地[1]。蒙医药中常用的是其中的多叶棘豆和硬毛棘豆，二者均收载于《中华人民共和国卫生部药品标准-蒙药分册》（1998年版）：多叶棘豆为豆科植物多叶棘豆Oxytropis myriophylla DC.的干燥全草，味苦、甘，性凉、钝、轻、糙，具有杀“粘”、清热、燥“协日乌素”，愈伤、生肌、锁脉、止血、消肿、通便的功效;硬毛棘豆为豆科植物硬毛棘豆Oxytropis hirta Bge.的干燥地上部分，味苦、甘，性凉、钝、轻、糙，具有杀“粘”、清热、燥“协日乌素”、愈伤、生肌、锁脉、止血、消肿、通便的功效[2]。据文献[3]报道，多叶棘豆和硬毛棘豆在临床上经常混用（如图1所示）。笔者前期已对多叶棘豆化学成分进行了综述[4]，另陈思有等[5]通过DNA条形码将多叶棘豆和硬毛棘豆进行鉴定，但多叶棘豆和硬毛棘豆显微特征、薄层色谱和HPLC特征图谱对比研究，均未见文献报道。多叶棘豆和硬毛棘豆总黄酮成分含量对比研究，仅有1篇文献[6]报道。鉴于上述研究现状，本实验拟以多叶棘豆和硬毛棘豆为研究对象，从显微特征、薄层色谱、HPLC特征图谱和总黄酮含量等方面对多叶棘豆和硬毛棘豆进行对比研究，以期为多叶棘豆和硬毛棘豆的合理应用提供参考。

1.1 仪器与材料 Nikon E200电子显微镜和DS-U3拍照装置（北京恒三江仪器有限公司）;多叶棘豆Oxytropis myriophylla和硬毛棘豆Oxytropis hirta采自内蒙古蒙医药工程技术研究院药草园，经内蒙古民族大学蒙医药学院吴香杰教授鉴定为正品，标本保存于内蒙古蒙医药工程技术研究院标本室;水合氯醛、稀甘油均为分析纯试剂。

1 显微特征对比研究

1.2 方法与结果 根据《中国药典》2015年版四部通则2001显微鉴别法[7]规定，取多叶棘豆和硬毛棘豆粉末适量，水合氯醛、稀甘油制片进行显微观察，生物光学显微镜下观察显微特征，结果如图2所示。由图2可知，多叶棘豆和硬毛棘豆药材粉末的导管均为螺纹导管和具缘纹孔导管，直径约8～45 μm;气孔为不定式气孔，类圆形或椭圆形，直径10～35 μm;纤维多成束，碎断，壁较厚，直径8～38 μm;木栓细胞直径约18～62 μm，二者（根部）均存在。综上所述，二者粉末显微特征基本相似，无显著差异，组织切片显微特征对比研究待进一步开展。

2 基于薄层色谱的多叶棘豆和硬毛棘豆对比研究

2.1 仪器与材料 硅胶G板（青岛海洋化工公司）;聚酰胺薄膜（浙江省台州市路桥四甲塑料厂）;ZF-02S型紫外分析仪（北京君意东方电泳设限公司）;多叶棘豆Oxytropis myriophylla和硬毛棘豆Oxytropis hirta采自内蒙古蒙医药工程技术研究院药草园，经内蒙古民族大学蒙医药学院吴香杰教授鉴定为正品，标本保存于内蒙古蒙医药工程技术研究院标本室;槲皮素（117-39-5，上海源叶生物科技公司）;异鼠李素（480-19-3，上海源叶生物科技公司）;芦丁（153-18-4，上海源叶生物科技公司）;乙酸乙酯、甲醇、甲酸、冰醋酸均为分析纯试剂。

2.2 方法与结果 供试品溶液的制备：分别取多叶棘豆和硬毛棘豆1 g，加65%乙醇10 mL，加热回流2 h，滤过，滤液蒸干，残渣用1 mL甲醇溶解，备用。

对照品溶液的制备：分别取槲皮素、异鼠李素、芦丁0.5 mg，用1 mL甲醇溶解，作为对照品溶液，备用。

展开与检视：分别取多叶棘豆、硬毛棘豆、槲皮素、异鼠李素、芦丁溶液各3 μL，点于聚酰胺薄膜上，用甲醇-水-冰醋酸=12∶3∶3展开，取出，晾干，365 nm紫外灯下检视，结果如图3所示;分别吸取多叶棘豆、硬毛棘豆溶液各3 μL，点于硅胶G板上，用乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水=15∶1∶1∶2展开，取出，晾干，10%硫酸-乙醇显色，电吹风加热至斑点清晰，结果如图3所示。由图3可知，多叶棘豆和硬毛棘豆化学成分均很复杂，二者化学成分存在较大差异。

3 基于HPLC特征图谱的多叶棘豆和硬毛棘豆对比研究

3.1 仪器与材料 Ultimate 3000高效液相色谱仪（LC-20AT四元泵、SIL-20A自动进样器、CTO-20A柱温箱、SPD-M20A紫外检测器）;超声波清洗器SK8200 HP（上海科导超声仪器公司）;METTLER-TOLEDO AG-285型电子分析天平（METTLER-TOLEDO有限公司）;多叶棘豆Oxytropis myriophylla和硬毛棘豆Oxytropis hirta采自内蒙古蒙医药工程技术研究院药草园，经内蒙古民族大学蒙医药学院吴香杰教授鉴定为正品，标本保存于内蒙古蒙医药工程技术研究院标本室;乙腈为色谱纯;乙酸为分析纯;蒸馏水自制。

3.2 方法与结果 色谱条件：色谱柱为Waters Xterra MS C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱;流动相为乙腈-0.4%乙酸水溶液，梯度洗脱程序见表1;检测波长为260 nm;柱温30℃;流速1 mL/min;进样量10 μL。

供试品溶液的制备：分别取多叶棘豆和硬毛棘豆0.5 g，加65%乙醇10 mL，密塞，称定重量，超声处理40 min，取出，放冷，再称定重量，65%乙醇补足减失重量，摇匀，滤过。滤液经0.22 μm微孔滤膜滤过，即得。

HPLC特征图谱建立：分别吸取多叶棘豆、硬毛棘豆供试品溶液各10 μL，进样，按表1程序进行梯度洗脱，得到多叶棘豆和硬毛棘豆HPLC特征图谱，结果如图4所示。由图4可知，多叶棘豆和硬毛棘豆化學成分均很复杂，二者化学成分存在较大差异。

4 总黄酮含量对比研究

4.1 仪器与材料  FW-177高速万能粉碎机（天津市泰斯特仪器公司）;752-PC紫外-可见分光光度计;HW-526数显恒温水浴锅（上海恒科学仪器公司）;BS224 S分析天平（北京赛多利斯仪器有限公司）;多叶棘豆Oxytropis myriophylla和硬毛棘豆Oxytropis hirta采自内蒙古蒙医药工程技术研究院药草园，经内蒙古民族大学蒙医药学院吴香杰教授鉴定为正品，标本保存于内蒙古蒙医药工程技术研究院标本室;芦丁（153-18-4，上海源叶生物科技公司）;亚硝酸钠（天津市永大化学试剂公司）;硝酸铝（天津市大茂化学试剂公司）;氢氧化钠（天津市大茂化学试剂公司）;95%乙醇（天津市永大化学试剂公司）;其他试剂均为分析纯。

4.2 方法[8]与结果

4.2.1 供试品溶液的制备 分别取粉碎过40目的多叶棘豆和硬毛棘豆药材粉末各5 g，加入50 mL 65%乙醇，称定重量，加热回流2 h，放冷，再称定重量，65%乙醇补足减失的重量，过滤，摇匀，即得供试品溶液。

4.2.2 对照品溶液的制备 精密称定10.08 mg芦丁标准品，置于50 mL容量瓶中，加65%乙醇溶解，稀释至刻度，配制成0.2 mg/mL对照品溶液，冷藏备用。

4.2.3 标准曲线的绘制 从不同浓度（0.02 mg/mL、0.04 mg/mL、0.06 mg/mL、0.08 mg/mL、0.1 mg/mL、0.12 mg/mL）芦丁标准品溶液中精密量取1 mL，分别置于10 mL量瓶中，加入5%亚硝酸钠溶液0.3 mL，静置6 min后，再加入10%硝酸铝0.3 mL，再静置6 min，最后加入4%氢氧化钠试液4 mL，加入65%乙醇至刻度，摇匀，静置15 min。采用紫外-可见分光光度法，以65%乙醇为参比溶液，在510 nm处测吸光度，以标准溶液浓度（X）为横坐标，吸光度（Y）为纵坐标，绘制标准曲线。得回归方程：Y=11.49X+0.0179，r2 = 0.9990。结果表明，芦丁对照品在0.02～0.12 mg/mL范围内线性关系良好。如图5所示。

4.2.4 方法学考察 精密度试验：精密吸取多叶棘豆供试品溶液1 mL，照“4.2.3”项下制备方法显色并测定吸光度，连续测定6次，RSD为0.36%，表明仪器精密度良好。

稳定性试验：在室温下，精密吸取多叶棘豆供试品溶液1 mL，照“4.2.3”项下制备方法显色后，放置0、5、10、15、20、25 min后测定其吸光度，计算RSD为2.29%，表明供试品溶液在25 min内稳定性良好。

重复性试验：取同一批多叶棘豆药材，照供试品溶液的制备方法制得6份供试品溶液，各取1 mL，照“4.2.3”项下制备方法显色并测定吸光度，计算所得总黄酮的平均含量为0.332 mg/g，RSD为2.54%。表明该方法重复性良好。

加样回收率试验：精确吸取已知含量的多叶棘豆供试品溶液0.5 mL，共6份，分别加0.2 mg/mL的芦丁标准品溶液0.5 mL，照“4.2.3”项下制备方法显色并测定吸光度，计算回收率。平均回收率为94.66%，RSD为2.46%，表明该方法具有良好的准确度。见表2。

4.2.5 多叶棘豆和硬毛棘豆总黄酮含量测定 分别称取多叶棘豆5.0228 g和硬毛棘豆5.0218 g，按照前述方法测定多叶棘豆和硬毛棘豆中总黄酮含量。实验結果表明，多叶棘豆中总黄酮含量为0.552 mg/g，硬毛棘豆中总黄酮含量为0.793 mg/g。

5 讨论

多叶棘豆和硬毛棘豆分别为豆科植物多叶棘豆Oxytropis myriophylla DC.和硬毛棘豆Oxytropis hirta Bge.的干燥全草，二者均具有杀“粘”、清热、燥“协日乌素”、愈伤、生肌、锁脉、止血、消肿、通便的功效，且二者在临床上经常混用[2-3]。本实验从显微特征、TLC、HPLC特征图谱和总黄酮含量四方面对多叶棘豆和硬毛棘豆进行对比研究，发现：①多叶棘豆和硬毛棘豆药材粉末显微特征无显著性差异;②二者的薄层色谱存在显著差异，硬毛棘豆化学成分更为复杂;③二者的HPLC特征图谱也存在不小差异，总体上讲，硬毛棘豆化学成分更为复杂，这与薄层色谱显示结果一致;④总黄酮含量方面，硬毛棘豆总黄酮含量（0.793 mg/g）高于多叶棘豆总黄酮含量（0.552 mg/g）。综上所述，多叶棘豆和硬毛棘豆在化学成分方面存在着一定的差别，建议临床医生谨慎选用。

另外，多叶棘豆和硬毛棘豆在蒙医临床中应用广泛[9]，但二者现行标准仍为1998版蒙药分册部颁标准，急需完善更新[10-11]，本研究可为二者质量标准修订完善工作提供一定的参考。

参考文献

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[10]李杰，鲍福贵，韩翠玲，等.蒙药产业所用药材现状分析[J].中国民族医药杂志，2016，22（10）：45-47.

[11]李杰，邢界红.《中国药典》2010年版一部所载蒙药品种情况评述[J].中国药品标准，2011，12（5）：328-330.

（收稿日期：2020-04-16 编辑：陶希睿）

基金项目：内蒙古自治区蒙药工程研究中心开放基金项目（MDK2017073）;内蒙古民族大学博士科研启动基金项目（BS464）;内蒙古自治区自然科学基金项目（2019BS08017）。

作者简介：杨立国（1985-），男，汉族，博士，讲师，研究方向为蒙药化学成分研究。E-mail： yangliguo5366@163.com