电压调制型高灵敏电化学发光分析

张晶晶，金 融，方丹君，江德臣

（1.南京医科大学药学院,南京211166；2.南京大学化学化工学院,生命分析化学国家重点实验室,南京210023）

电化学发光（ECL）是化学分子经历电化学反应过程而产生的一种光辐射现象，是电化学方法和化学发光方法相结合的产物.由于无需额外的激发光源，从而有效避免了光散射对于检测信号的干扰，因此ECL分析具有低背景和高检测灵敏度的优点，已成为一种强大的分析技术，广泛应用于生物传感器［1，2］、有机发光二极管［3］、食品［4，5］和药物分析［6，7］等领域. 然而，ECL探针的发光效率较低，较难实现对低浓度分析物的检测.为了增强ECL信号、提高检测灵敏度，基于各种信号放大策略的ECL分析方法不断发展起来.如，通过引入功能纳米材料来提高信号分子的负载量或者促进发光分子的电子传递速率，以实现信号的放大［8～10］；引入酶分子，通过酶催化反应产生对发光分子具有增敏作用的物质以增强发光强度［11～13］；设计各种类型的传感模型来提高检测灵敏度［14～16］. 鉴于ECL反应受电极界面特征及电压模式共同控制，若能发展新型电压模式以增强ECL信号强度，则可建立一种通用性高的增强型ECL检测方法.

Scheme 1 Schematic voltage modulated ECL mecha⁃nism for L012⁃hydrogen peroxide system

ECL方法通常依靠直流电压来激发电化学反应产生光信号.以经典的ECL体系—鲁米诺-过氧化氢为例，当对检测体系施加一定的电压后，鲁米诺和过氧化氢分子在电极表面发生电化学氧化反应［17，18］，形成偶氮化合物、超氧基阴离子或过氧化氢阴离子，随后相互反应生成激发态的3-氨基邻苯二甲酸离子，激发态返回基态时会产生光辐射.这种快速的电化学反应使电极表面液层内鲁米诺和过氧化氢分子的浓度迅速降低，产生浓差极化，不利于ECL过程的发生，进而造成ECL强度下降.为了有效克服浓差极化对于ECL发光效率的影响，本文尝试建立基于电压调制的新型电压驱动模式，以提高ECL强度及检测的灵敏度.如Scheme 1所示，采用的电压调制模式是在原有恒定电压基础上，增加一个周期性的小幅度三角波电压.实验结果表明，与恒定电压激发的ECL信号相比，这种新型电压 调制模式能够将ECL信号强度提升约2倍，且调高的幅度与三角波电压的频率和幅度有关.在最佳条件下，基于该电压调制型ECL方法能够对低达1.0 nmol/L的过氧化氢进行高灵敏检测，提高了检测 的灵敏度.这种通过调制施加电压的放大策略不仅提供了一种通用性高的增强型ECL技术；而且有助于深入理解电极界面上电化学过程的机理及调控机制，为研究电化学机理提供了一套新的技术和数据.

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

8-氨基-5-氯-7-苯基吡啶并［3，4-d］哒嗪-1，4-（2H，3H）-二酮（L012）购于日本Wako公司；过氧化氢（质量分数30%）溶液购于上海生工公司；PBS缓冲溶液（10×，80.0 g NaCl+2.0 g KCl+14.4 g Na2HPO4+2.4 g KH2PO4）溶于1.0 L超纯水中，pH调至7.4.使用前，将10×PBS缓冲溶液用超纯水稀释成pH=7.4的1×PBS缓冲溶液.所用试剂均为分析纯，使用前未经纯化处理.实验用超纯水由Millipore UPH-Ⅱ-5T型水净化系统制得（电阻率：18.2 MΩ/cm）.

ECL检测在实验室自行搭建的电化学发光检测系统上进行.

1.2 实验过程

实验采用三电极体系：用O型圈在氧化铟锡（ITO）电极上固定直径为4.0 mm的导电面积作为工作电极，Ag/AgCl电极作为参比电极，铂丝为辅助电极.电解液为包含500 μmol/L L012的1×PBS缓冲溶液（pH=7.4）.在电压调制模式下，施加电压范围为（V0－∆V）～（V0+∆V）（V0为恒定电压，∆V为三角波电压幅度），电压频率在5～750 Hz范围内变换.ECL信号通过光电倍增管收集.在检测过氧化氢实验中，不同浓度的过氧化氢被加入到溶液中，并依次收集所产生的ECL信号.

2 结果与讨论

2.1 电压调制模式下ECL光强的增大幅度

实验中选择具有更强ECL发光效率的鲁米诺衍生物L012分子作为ECL发光物质，研究其在不同周期和幅度电压条件下的ECL光强.鉴于L012分子的氧化电压约为1.0 V，故选择恒定电压为1.0 V，三角波电压暂选为50 mV，将施加在电极上的电压从0.95～1.05 V进行线性扫描，频率为250 Hz，结果如图1（A）所示.施加电压后，立即观测到ECL信号（曲线a）；随后，由于L012分子在电极界面被消耗而形成浓差极化现象，导致ECL光强下降.与恒定电压（1.05及1.0 V）条件下的ECL光强（曲线b和c）相比，通过引入三角波的电压调制型ECL光强明显增大.该结果证明，由于施加电压处于变化过程中，其所产生的浓差极化程度将小于恒定电压条件下的状况，因此可有效提高ECL光强，显示出电压调制型ECL增大光强的可行性.

在1.0 V电压基础上分别施加不同幅度的三角波电压，并记录ECL光强.由图1（B）（曲线a）可以看出，随着三角波电压的增大，ECL曲线呈逐渐上升趋势.这主要由于施加较高的电压会促进L012在电极表面的ECL反应速度，从而导致ECL光强增大.类似的现象在对电极施加恒定电压时也会发生.如图1（B）曲线b所示，在1 V电压基础上增加一个恒定的微扰电压后，ECL光强随着电压的升高而变大.但是，通过对比电压调制型和恒电压型ECL平均光强发现，图1（C）所示的比值在电压幅度为50 mV时达到最大，增强近2倍.该结果表明电压调制型ECL通过输入周期变化的电压，可以有效缓解浓差极化现象带来的的ECL信号下降问题，起到增大发光强度的作用.为了验证该放大策略的通用性，对另外一个电化学发光经典体系—联吡啶钌-三乙胺（［Ru（bpy）3］2+-TPA）进行了研究.与恒定电压（1.25 V）条件下的发光信号相比，施加电压幅度为50 mV的电压调制模式（1.20～1.30 V）可以使电化学发光信号强度提升1.4倍.该结果表明基于电压调制调制模式的信号放大策略可用于多种电化学发光体系.

Fig.1 Curves for voltage modulated(a)ECL with an applied voltage between 0.95 and 1.05 V,and constant ECLs with a constant voltage of 1.05(b)and 1 V(c)(A),normalized luminescence ratio of vol-tage modu⁃lated(a)ECL and constant ECL(b)with different voltage amplitudes(B),increase fold between voltage modulated ECL and constant ECL with different voltage amplitudes(C),normalized luminescence ratio of voltage modulated ECL with different frequencies(D)

除了施加电极上的电压会对电化学反应产生影响外，三角波电压的频率也会影响电极界面的浓差极化现象，从而对ECL光强产生影响.因此，将三角波的电压频率从5 Hz调节到750 Hz，并记录所产生的ECL光强.由图1（D）可见，随着电压频率的上升ECL信号增强，并在频率为250 Hz时达到最高.鉴于平板电极表面建立稳定双电层的时间常数在毫秒级别，进一步增加频率会导致施加于电极界面电压的时间小于时间常数，造成电极界面中双电层难以迅速建立.由此可导致双电层的有效电压下降，使电化学发光进程受阻，最终表现为信号开始下降.根据该实验结果，确定了电压调制型ECL发光方法的最佳实验条件：三角波电压幅度为50 mV；频率为250 Hz.

2.2 电压调制型ECL检测过氧化氢

在最佳实验条件下，利用电压调制型ECL方法对过氧化氢进行检测.过氧化氢在该条件下会被氧化形成活性氧组分，与L012氧化的中间体发生反应，并释放出ECL信号.利用电压调制模式，在施加50 mV微扰电压的条件下考察了过氧化氢增强L012 ECL的性能，结果如图2（A）所示.随着过氧化氢的引入，ECL强度开始上升，其上升的幅度随着过氧化氢浓度的增大而逐渐提高.以不同过氧化氢浓度下的ECL强度对过氧化氢浓度作图，如图2（B）所示［插图为ECL强度与过氧化氢浓度（1.0 nmol/L～2.0 μmol/L）的关系图］.ECL强度与过氧化氢浓度在1.0 nmol/L～200 μmol/L范围内呈现良好的线性关系，线性回归方程为I=131.1+27.6c，相关系数R=0.986，对过氧化氢的检出限为0.24 nmol/L（S/N=3）.该结果表明，利用电压调制型ECL可以对过氧化氢进行灵敏检测.

为了进一步证明该方法检测过氧化氢的灵敏性，将该分析结果与其它方法进行了比较.由表1可见，电压调制型ECL检测技术在检测限和灵敏度方面均优于其它检测方法，表明通过抑制浓差极化现象可显著提高检测的灵敏度，为高灵敏ECL分析提供了一种新技术.更为重要的是，这种检测方法证实了可通过对电极界面上电化学基本过程的调节实现基于物理策略的信号放大.该研究将有助于深入理解电极界面电化学过程的机理及调控机制.

Fig.2 Luminescence curves of voltage modulated ECL with different concentrations of hydro⁃gen peroxide(A)and correlation of integrated luminescence with different concentrations of hydrogen peroxide(B)

Table 1 Comparison of the detection limits using different ECL methods

3 结 论

报道了一种通用性高的电压调制型电化学发光分析技术.与传统的恒电压方法相比，该新型电压调制模式能有效提高ECL信号.该方法对过氧化氢的检测具有较宽的线性范围和较低的检出限，为高灵敏ECL分析提供了新技术.