车前草对重金属铜和镍的积累及生理响应

刘丽杰，刘凯，孙玉婷，王璐瑶，丁美云，张东向，金忠民

(齐齐哈尔大学生命科学与农林学院，黑龙江 齐齐哈尔 161006)

重金属是指密度在5.0 g/cm3以上的金属元素，大约有45种元素.近年来，由于人类的生产和生活活动造成了重金属对环境的污染，尤其是对土壤的污染[1-2].植物修复技术从20世纪90年代开始作为一种治理污染土壤的新技术被推广应用[3].植物修复技术成本低、适应性广、操作方便、不破坏生态环境，并且不会引起二次污染.植物修复能够使重金属的移动性降低，从而避免重金属进入食物链[4]，因此重金属的植物修复技术表现出一定的市场经济价值和更加广阔的发展前景.

车前草(Plantagoasiatica)，又叫车轮菜、牛甜菜，是一种多年生草本植物.我国是车前草资源比较丰富的国家，南方和北方都有分布.车前草具重金属富集作用，且是一种生物量大，生长速度非常快的植物，因此具有很大的潜力成为土壤污染的修复植物.目前，关于车前草对重金属的积累方面已经有一定的研究，比如车前草对重金属Cu、P b、Cd、Ni、Zn等的吸附，主要集中在车前草对单一金属离子的吸附特性上[5-9]，关于车前草吸附重金属离子(尤其是复合金属离子)的机理以及重金属对车前草生理代谢方面的研究还比较少.因此，本研究利用生理生化的研究方法，对重金属Cu2+和Ni2+单一及复合污染下车前草对重金属的积累特性及生理生化指标进行了研究，旨为探究车前草如何抵御外界逆境胁迫，同时为为植物修复土壤污染提供理论依据.

1 材料与方法

1.1 供试材料

试验所用车前草种子，购于齐齐哈尔市齐丰种子公司.2019年3～6月在齐齐哈尔大学生命科学与农林学院植物生理与代谢实验室进行车前草盆栽试验.2019年3月对车前草种子进行播种，所用土壤采自齐齐哈尔市嫩江边，没有经过重金属处理.将播种后的花盆放到适宜的光照、水分和温度条件下，长出幼苗后待用.

1.2 试验设计

试验采用Cu和Ni 2因素4水平交互试验，具体处理见表1.取已经风干并过筛的土壤1 kg，均匀混合装入花盆(直径为16 cm，高度为16 cm)中，按表1中的浓度梯度加入重金属溶液，用CuSO4·5H2O和Ni (NO3)2·6H2O换算成质量，配成500 mL溶液加入到称好的土壤中，每个处理重复20次，以不加任何重金属的土壤作为对照.车前草幼苗生长3周后，将长势较一致并且状况良好的幼苗移栽到重金属处理后的花盆中，每盆栽3株.在车前草生长的过程中，根据土壤的水分情况适当浇水，保证植株正常生长.在2019年6月下旬收获重金属处理和对照的车前草植株，测定株高，并用自来水冲洗植株上的土壤，再用去离子水洗净，擦干，备用.

1.3 测定及计算方法

在进行重金属含量测定时，将车前草叶片和根部烘干，采用电感耦合等离子体质谱法进行测定[10].测定车前草的株高、地上和地下部分鲜重.在进行生理指标测定时用鲜样：MDA含量测定采用硫代巴比妥酸法；叶绿素含量测定采用丙酮法；POD活性的测定采用愈创木酚法[11]；SOD活性测定采用Spycbaha的方法[12]；CAT活性测定采用过氧化氢还原法[13].

重金属富集系数=植物体内重金属含量/土壤(或沉积物)中重金属含量(栽种车前草之前的含量)×100%

转移系数=地上部分的重金属含量/地下部分的重金属含量

耐性系数=植物在重金属胁迫下的最大根长/对照条件下的最大根长

1.4 数据统计和分析

采用Excel 2010进行图表制作，利用SPSS20.0对数据进行统计分析，并采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)进行数据间的差异显著性分析.

表1 Cu2+和Ni2+的不同配比组合

2 结果与分析

2.1 不同处理下车前草叶片和根中重金属Cu2+、Ni2+的含量

随着重金属Cu2+浓度的增加，车前草幼苗根中重金属Cu2+含量呈先升高后下降趋势(图1).Cu-Ni复合处理时，促进了根中Cu2+含量的增加.与对照相比，处理7、处理10、处理11、处理14和处理15根中Cu2+含量显著增加(P<0.05)；叶中重金属 Cu2+含量明显低于根，单独Cu2+处理以及Cu-Ni复合处理后的变化趋势与根相同，随着重金属Ni2+浓度的增加，车前草根中Ni2+含量逐渐增加，低浓度Cu2+处理对Ni2+含量的影响不大，当Cu2+浓度达到700 mg/kg以后，Ni2+含量随之增加，与对照相比，处理7、处理10、处理11、处理14和处理15的Ni2+含量显著增加(P<0.05)；车前草叶片中Ni2+含量显著低于根中的含量(P<0.05)，并且随着Cu2+和Ni2+含量的增加呈现上升趋势，处理15 Ni2+含量达到最大值，为540 mg/kg(图2).

同种器官的不同字母代表差异显著(P<0.05).Different letters of the same organs represent significant differences(P<0.05).图1 不同重金属处理后车前草叶片和根中Cu2+含量分布Figure 1 Distribution of Cu2+ contents in the leaves and roots of Plantago asiatica under different heavy metals treatments

不同器官的不同字母代表差异显著(P<0.05)Different letters of the same organs represent significant differences(P<0.05).图2 不同重金属处理后车前草叶片和根中Ni2+含量分布Figure 2 Distribution of Ni2+ contents in the leaves and roots of Plantago asiatica under different heavy metal treatments

2.2 不同处理下车前草对Cu2+和Ni2+的富集系数、转移系数和耐性系数变化

富集系数指植物中某种重金属的含量与灌溉溶液中该种重金属含量的比值.随着重金属 Cu2+浓度的增加，车前草对Cu2+的富集系数呈现整体下降的趋势；Cu-Ni复合处理下，富集系数先上升后下降，除了处理1(Cu2+为200 mg/kg，Ni2+为100 mg/kg)外，其他处理与对照相比差异显著(P<0.05)(图3).随着Ni2+浓度的增加，车前草对Ni2+的富集系数也呈现整体下降的趋势；Cu-Ni复合处理后促进了富集系数的下降.与对照相比，只有处理7差异显著(P<0.05).

同种重金属不同字母代表差异显著(P<0.05).Different letters of the same metal represent significant differences(P<0.05).图3 车前草对铜和镍的富集系数变化Figure 3 Changes of enrichment coefficient of Cu2+ and Ni2+ of Plantago asiatica

转移系数指植物地上部分重金属浓度与根中该种重金属浓度的比值.在本研究中车前草的Cu2+转移系数逐渐降低，但变化不显著(图4).Cu-Ni复合处理使转移系数下降更快，但只有处理7、处理11、处理14和处理15( Cu2+为1200 mg/kg，Ni2+为200 mg/kg)下降达到显著水平(P<0.05)；随着重金属Ni2+浓度的增加，车前草的Ni2+转移系数表现出上升的趋势，Cu-Ni复合处理促进了转移系数的升高.除了处理1、处理2、处理4和处理5与对照相比差异不显著外，其余处理均显著高于对照(P<0.05).

同种重金属不同字母代表差异显著(P<0.05).Different letters of the same metal represent significant differences(P<0.05).图4 车前草对铜和镍的转移系数变化Figure 4 Changes of transfer coefficient of Plantago asiatica of Cu2+ and Ni2+

耐性系数可用来评价植物对重金属的耐性，指植物在重金属胁迫下的最大根长与对照条件下的最

图5 车前草对铜和镍的耐性系数变化Figure 5 Changes of tolerance coefficient of Plantago asiatica to Cu2+ and Ni2+

大根长的比值.由图5可知，Cu2+的增加对车前草耐性系数的变化影响较小，但随着Ni2+的增加，车前草的耐性系数则呈现先升后降的趋势，除了处理1以外，均显著高于对照(P<0.05)，处理10(Cu2+为700 mg/kg，Ni2+为150 mg/kg)达到最大值1.4.

2.3 不同浓度重金属处理下车前草生长特性指标的变化

重金属Cu 和Ni单一和复合处理都使车前草的株高降低，单独Ni处理时与对照差异不显著，单独Cu处理以及复合处理组的株高都显著低于对照(P<0.05)(图6).

图6 不同重金属处理下车前草株高变化Figure 6 Plant height changes of Plantago asiatica under different heavy metal treatments

重金属Cu 和Ni单一和复合处理都使车前草的地上部分和地下部分生物量减少.单独Cu处理时，Cu2+浓度达到700 mg/kg以上时，生物量显著低于对照(P<0.05)；单独Ni处理时，Ni2+浓度达到200 mg/kg，生物量显著低于对照(P<0.05)；Cu-Ni复合处理后，除了处理5和处理6以外，其他处理的生物量均显著低于对照(P<0.05)(图7).

图7 不同重金属处理下车前草生物量变化Figure 7 Biomass changes of Plantago asiatica under different heavy metal treatments

2.4 不同重金属处理下车前草叶片MDA含量的变化

由图8可知，单独Cu2+处理时，MDA含量都显著高于对照(P<0.05)；单独Ni2+处理时，MDA含量叶都高于对照，但差异都不显著；两种重金属复合处理时，MDA含量都显著高于对照(P<0.05).

图8 车前草MDA含量变化Figure 8 Changes of MDA content of Plantago asiatica

2.5 不同重金属处理下车前草叶片叶绿素含量的变化

由图9可知，单独重金属Cu2+和Ni2+的浓度增加使车前草叶片叶绿素含量先增加后下降，单独重金属Cu2+处理时，低浓度Cu2+处理时增加不显著，但当重金属Cu2+达到700 mg/kg(处理8)时,叶绿素含量显著下降(P<0.05)，与对照相比下降20%；单独重金属Ni2+处理时，叶绿素含量先增加后下降，在Ni2+浓度为200 mg/kg时,叶绿素显著低于对照(P<0.05)；两种重金属复合处理时，处理5、处理6、处理10叶绿素含量高于对照，处理7、处理9、处理11、处理13和处理15均显著低于对照(P<0.05).

图9 车前草叶绿素含量变化Figure 9 Changes of chlorophyll content of Plantago asiatica

2.6 不同重金属处理下车前草叶片抗氧化酶活性的变化

由图10可知：单独重金属Cu2+处理使SOD活性增强，但差异没有达到显著水平；而单独Ni2+处理也使SOD活性增加，但仅在Ni2+浓度达到200 mg/kg(处理3)时差异达到显著水平(P<0.05)，此时SOD活性为对照的1.38倍；两种重金属复合处理时，SOD活性均显著高于对照，处理15(Cu2+浓度为1 200 mg/kg，Ni2+浓度为200 mg/kg)达到最高值，为对照的1.77倍.

图10 车前草SOD活性变化Figure 10 Changes of SOD activity of Plantago asiatica

由图11可知：单独重金属Cu2+处理和单独Ni2+处理都使POD活性增强，但差异均没有达到显著水平；两种重金属复合处理时，POD活性都高于对照，除了处理5(Cu2+浓度为200 mg/kg，Ni2+浓度为100 mg/kg)和处理6(Cu2+浓度为200 mg/kg，Ni2+浓度为150 mg/kg)，其他处理均与对照差异显著，处理15(Cu2+浓度为1 200 mg/kg，Ni2+浓度为200 mg/kg)达到最高值，为对照的2.15倍.

图11 车前草POD活性变化Figure 11 Changes of POD activity of Plantago asiatica

由图12可知，重金属Cu2+和Ni2+单独及复合处理都使CAT活性增强，仅在处理1(Cu2+浓度为0 mg/kg，Ni2+浓度为100 mg/kg)、处理4 (Cu2+浓度为200 mg/kg，Ni2+浓度为0 mg/kg)和处理5(Cu2+浓度为200 mg/kg，Ni2+浓度为100 mg/kg)时，与对照相比差异不显著，其他处理均显著高于对照，并且两种重金属复合处理时，CAT的活性高于Cu2+和Ni2+单独处理，在Cu2+和Ni2+均达到最高值时(处理15)，CAT活性也达到最高值，为对照的4.1倍.

图12 车前草CAT活性变化Figure 12 Changes of CAT activity of Plantago asiatica

3 讨论

3.1 车前草对Cu2+和Ni2+的积累及富集特征

重金属铜(Cu)和镍(Ni)是植物生长发育必需的微量营养元素，很容易被植物吸收，但是过量的铜和镍会使植物受到毒害[14-15].在本研究中， 一定浓度的Cu2+和Ni2+处理后，车前草仍然能够正常生长，说明车前草对铜和镍都具有非常强的抗性.随着重金属Cu2+和Ni2+浓度的增加，车前草的地上部分和地下部分Cu2+和Ni2+含量也逐渐增加，地下部分Cu2+和Ni2+含量显著高于地上部分，说明车前草根部积累了大部分重金属Cu2+和Ni2+，少量转移到地上部分，地下部分根作为植物吸收土壤中Cu2+和Ni2+的第一个器官，对植物抵抗外界环境Cu2+和Ni2+毒害起到非常重要的作用，这与陆引罡等[16]的研究结果一致.铜和镍复合处理促进了车前草对Cu2+和Ni2+的吸收,使车前草地上部分和地下部分Cu2+和Ni2+的含量都有所增加，说明Cu-Ni复合污染对车前草富集Cu和Ni可能有协同作用，这与车前草在Cd-Pb复合污染时对其富集Cd有协同作用的研究结果相似[17].

车前草对重金属Cu2+的转移系数随着重金属Cu2+浓度的增加而逐渐减小，说明土壤中 Cu2+浓度的增加对车前草Cu2+从地下部分向地上部运输有一定的抑制作用，这与杨樱[18]在车前草对重金属铜的富集方面的的研究结果基本一致，并且低浓度重金属Ni2+可抑制Cu2+向地上转运，但随着Ni2+浓度的增加，车前草对重金属Cu2+的转移系数也逐渐增加，可见Cu-Ni复合污染对Cu2+向地上部分转移具有一定的协同作用；车前草对重金属Ni2+的转移系数随着重金属Ni2+的增加而逐渐增加，土壤中Ni2+浓度的增加对车前草Ni2+从地下部分向地上部运输有一定的促进作用，这与高凌颜等[19]对旱伞草铜富集及吸收的研究结果相似,当铜和镍复合处理时，Cu2+浓度的增加可促进Ni2+转移到地上部分，即Cu-Ni复合污染对Ni2+向地上部分转移也具有一定的协同作用.

富集系数是反映植物对重金属离子富集能力大小的指标，当植物对某种重金属的富集系数大于1时，便可认定该种植物对此种重金属具有富集能力，富集系数越大说明植物对该金属的吸收能力越强，一般来说，富集系数大于10的植物可认定为对某种重金属超富集植物[20].在本研究中Cu2+的富集系数随着重金属Cu2+浓度的提高而逐渐降低，对照组和处理4(Cu2+浓度为200 mg/kg、Ni2+浓度为0)和处理8(Cu2+浓度为700 mg/kg、Ni2+浓度为0)时，车前草对Cu2+的富集系数都大于1，说明车前草是铜富集植物，但没有达到超富集的水平，但Cu-Ni复合处理降低了车前草对Cu2+的富集；车前草对Ni2+的富集系数也随着重金属浓度的提高而逐渐下降，在低浓度Ni2+处理时，车前草对Ni2+的富集系数>1,说明车前草也是镍富集植物，这与魏芳雪等[21]对车前草的研究结果基本一致，并且Cu-Ni复合处理使车前草对Ni2+的富集系数进一步下降，当Cu2+浓度达到最高值时有所升高，但变化幅度很小.

3.2 车前草对Cu2+和Ni2+处理的生理响应

重金属处理后，车前草的株高降低，生物量减少，当重金属浓度达到其阈值后生物量显著降低，说明此时重金属浓度已经影响到车前草的正常生长，已达到车前草吸附重金属的极限.植物在正常情况下，其体内的各项生理代谢过程都是协调且稳定的，一旦植物遇到逆境胁迫时，其体内的各种代谢活动会受到影响而失去平衡，这时植物会对逆境作出反应，细胞膜系统会受到一定的损伤，膜脂会发生过氧化，而产生MDA，MDA含量的多少可以反应逆境下植物受伤害的程度，MDA的含量越高，植物细胞膜受到的伤害就越严重[22].当车前草受到重金属Cu2+和Ni2+毒害后，细胞膜的透性增加，膜系统受到损害，MDA的含量增加，这与胡雪华等[23]在铝胁迫对车前草影响的研究结果基本一致.尤其是当两种重金属同时处理时，MDA含量增加的幅度更大，当两种重金属都达到最高浓度时，MDA含量达到峰值，是对照的4倍.但在低浓度重金属Cu2+和Ni2+处理时，MDA含量增加的幅度较小，这可能是车前草对重金属 Cu2+和Ni2+具有一定抗性的重要原因之一.

当植物遭受逆境胁迫时，细胞内会积累大量的活性氧，使其代谢失去平衡，最终造成细胞膜系统发生严重的氧化损伤[24-25].逆境胁迫会使植物体内抗氧化防御系统活性增强，从而防止细胞内过量积累的活性氧对植物造成的氧化伤害.保护酶体系 SOD、POD和CAT能够对过氧化物起到一定的清除作用，从而防止自由基对植物的毒害.在本试验中，在一定的范围内SOD、POD和CAT 3种酶的活性都随着 Cu2+和Ni2+浓度的增加而呈现出上升的趋势，这个趋势与焦轶男等[26]的研究结果并不完全一致，他们的结果是先上升后下降.Cu-Ni复合处理使两种保护酶活性上升的幅度增大，说明Cu2+和Ni2+可能导致了细胞内外过氧化物的累积，此时，车前草体内的保护酶体系便会启动，对胁迫作出相应的反应，从而对车前草有机体进行保护.两种重金属复合处理时，保护酶的反应更加迅速而有效，在保护酶活性的变化中都表现出上升的趋势，这种上升趋势一直在增加，说明没有超过 SOD、POD和CAT的忍受范围，它们的蛋白质结构还没有受到较大的破坏.

4 结论

本研究结果表明，车前草可以在一定浓度的重金属Cu2+和Ni2+处理下积累铜和镍(单独Cu2+700 mg/kg以内、Ni2+200 mg/kg以内，以及Cu2+200 mg/kg、Ni2+100 mg/kg；Cu2+200 mg/kg、Ni2+150 mg/kg范围内的Cu-Ni复合处理)，存在明显的生理适应，具有一定的修复潜能.但本试验仅从车前草对重金属铜和镍的积累量、富集特征、生理响应几方面分析了车前草对铜和镍单独及复合污染修复的机理，更加深入的毒害机理，如车前草的根系微生物是否和植物共同作用等，还有待于从分子及细胞水平进一步研究.