大蒜粉薄层色谱鉴别方法的建立

邓丽娟 刘睿婷 胡小霞 黄 琼 李新霞

1.新疆埃乐欣药业有限公司，新疆 乌鲁木齐 830013 2.新疆医科大学，新疆 乌鲁木齐 830011

大蒜(AlliumsativumL.)是世界公认的药食两用植物，也是为数不多以鲜品形式收录于中国药典的药材，能解毒消肿、杀虫、止痢，用于痈肿疮疡、疥癣、肺痨、顿咳、泄泻、痢疾等疾病治疗[1]。现代医学研究证明大蒜功效成分具有抗感染[2]、抗肿瘤[3]、防治心脑血管疾病[4]、保护肝脏[5]、提高机体免疫力[6]、降三高[7-8]等作用。但是新鲜大蒜保质期太短，即使存放在2～8 ℃的冷库中超过10个月也会变质。文献研究证实将新鲜大蒜冷冻干燥，加工成蒜片或蒜粉，在冷库中可保质5年以上，有较强的蒜辣味，且杀菌的效果与新鲜大蒜一致[9]。由于大蒜冻干粉具有：制备工艺简单、零添加、生产成本低、储存运输方便，尤其是完整的保留大蒜的功效成分等优势，被美国药典[10]、英国药典[11]和欧盟药典[12]收录作为膳食补充剂，而中国药典仅收录大蒜药材标准，缺少大蒜粉这一品种，严重限制了大蒜药用及保健制剂的开发。因此，急需建立大蒜粉相关质量标准，为制备安全、有效、质量可控的大蒜类保健食品和药品提供科学依据。

世界公认大蒜的活性成分是蒜酶催化蒜氨酸产生的大蒜辣素，大蒜辣素极不稳定，可进一步分解产生系列含硫化合物[13]。蒜氨酸是大蒜辣素的前体物质，化学性质相对稳定，美国药典以蒜氨酸和甲硫氨酸作为大蒜粉的薄层鉴别成分，英国药典和欧盟药典大蒜粉的薄层鉴别以丙氨酸替代蒜氨酸，现有文献仅报道了大蒜原药材、有效部位蒜氨酸薄层鉴别方法[14-16]，对大蒜粉薄层鉴别方法的研究鲜有报道。本研究参考美国药典、欧盟药典、英国药典大蒜粉质量标准及相关文献，建立大蒜粉薄层鉴别方法，为大蒜粉的质量控制提供依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器 电子天平(AB135-S，梅特勒-托利多国际贸易有限公司)，硅胶G薄层板(青岛海洋化工分厂，德国Merk公司，安徽良臣硅源材料有限公司)。

1.2 试药 甲醇(分析纯，天津百世化工)、正丁醇(分析纯，天津永晟精细化工)、正丙醇(分析纯，西安化学试剂厂)、冰乙酸(分析纯，天津富宇精细化工)、无水乙醇(分析纯，天津富宇精细化工)、茚三酮(分析纯，上海试剂三厂)。

蒜氨酸对照品(批号AL080428，新疆埃乐欣药业有限公司)。

大蒜粉为来自不同产地的大蒜鳞茎经去皮，切碎、真空冷冻干燥加工制成，其中Y201811001批次来源于新疆皮山县桑珠乡，Y201811004、Y201811005和2018110006来源于新疆皮山县克里昂乡，Y201904003批次来源于新疆吉木萨尔县，Y201901021批次来源于新疆且末县。生产加工方为新疆埃乐欣药业有限公司。

2 方法与结果

2.1 溶液的配制

2.1.1 对照品溶液的制备 取蒜氨酸对照品适量，加50%甲醇溶液制成每1mL含1mg的溶液，即得。

2.1.2 供试品溶液的制备 称取1 g大蒜粉，加甲醇5 mL，振摇，静置，取上清液即得。

2.1.3 茚三酮溶液的配制 显色剂1(英国/欧盟药典)：精密称取适量茚三酮，加冰乙酸—丁醇=5∶95溶液溶解，制成2 g/L茚三酮溶液(冰乙酸-丁醇，5∶95)。

显色剂2(美国药典)：精密称取适量茚三酮，加正丁醇-2 moL/L冰乙酸=19∶1溶液溶解，制成0.2%茚三酮溶液(正丁醇-2 mol/L冰乙酸溶液，19∶1)。

显色剂3：精密称取适量茚三酮，加无水乙醇溶解，制成2 g/L茚三酮无水乙醇溶液。

2.3 薄层色谱条件优选

2.3.1 供试品制备方法考察 分别按照三种方法制备供试品溶液：

①欧盟药典供试品溶液制备： 取1 g大蒜粉，加甲醇5 mL，振摇60 s，滤过，作为供试品溶液1。

②美国药典供试品溶液制备：取1 g大蒜粉，加甲醇-水(1∶1)20 mL，超声10 min，离心(转速为8000转/min)10 min，取上清液，沉淀加甲醇-水(1∶1)20 mL，再超声10 min，合并两次上清液，浓缩至5 mL，作为供试品溶液2。

③课题组方法供试品溶液制备：取1g大蒜粉，置具塞锥形瓶中，加50%甲醇20 mL溶解，超声10 min，离心(转速为8000转/min)10 min，取上清液，作为供试品溶液3。

分别取对照品溶液和上述供试品溶液各5 μL，点于同一薄层板上，以正丁醇-冰醋酸-水(4∶1∶1)展开剂，展开，取出，晾干，喷以0.2%茚三酮乙醇溶液，在105 ℃下加热至斑点清晰，检视，如图1所示。结果表明：三种方法制备的供试品溶液主斑点与对照品溶液斑点的颜色、位置相同，均有较好的分离度，故供试品溶液制备方法选择操作简单的欧盟药典方法。

从左到右依次为：对照品溶液、供试品溶液1、供试品溶液3、供试品溶液2图1 不同供试品制备方法比较

2.3.1 展开系统选择 吸取对照品溶液与供试品溶液各5μL，点于同一薄层板上，分别以冰乙酸-丙醇-水-无水乙醇(1∶1∶1∶2)、正丁醇-正丙醇-冰乙酸-水(3∶1∶1∶1)、正丁醇-冰醋酸-水(4∶1∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，再喷氨基酸专属显色剂0.2%茚三酮乙醇溶液，在105℃加热，蒜氨酸斑点均清晰可见，如图2所示。采用冰乙酸-丙醇-水-无水乙醇(1∶1∶1∶2)为展开剂，展开，对照品溶液与供试品溶液Rf(0.7)值较大，且分离度较差；采用正丁醇-正丙醇-冰乙酸-水(3∶1∶1∶1)和正丁醇-冰醋酸-水(4∶1∶1)为展开剂，展开，对照品溶液与供试品溶液Rf(0.43-0.48)值适中，分离度均良好，确定配制方法简单、使用有机溶剂种类少的正丁醇-冰醋酸-水(4∶1∶1)为最佳展开系统。

A B C左：对照品溶液；右：供试品溶液A.冰乙酸-丙醇-水-无水乙醇(20∶20∶20∶40)；B.正丁醇-正丙醇-冰乙酸-水(3∶1∶1∶1)；C.正丁醇-冰醋酸-水(4∶1∶1)图2 展开剂考察结果

A B C左：对照品溶液；右：供试品溶液A.2g/L茚三酮溶液(冰乙酸-丁醇，5∶95)；B.0.2%茚三酮溶液(正丁醇-2 mol/L冰乙酸溶液，19∶1)；C.0.2%茚三酮无水乙醇溶液图3 显色剂考察结果

2.3.2 显色剂的选择 吸取对照品溶液与供试品溶液各5μL，点于同一薄层板上，以正丁醇-冰醋酸-水(4∶1∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，分别喷以2 g/L茚三酮溶液(冰乙酸-丁醇，5∶95)、0.2%茚三酮溶液(正丁醇-2 moL/L冰乙酸溶液，19∶1)、0.2%茚三酮乙醇溶液三种显色剂，在105 ℃加热至斑点颜色清晰，检视，如图3所示。结果表明，三种显色剂均可使主斑点显色清晰，故选择制备方法简单，使用有机溶剂种类最少的课题组方法，即0.2%茚三酮无水乙醇溶液为显色剂。

从左到右依次为：对照品溶液3 μL、5 μL、7 μL，供试品溶液3 μL、5 μL、7 μL图4 点样量考察结果

2.3.3 点样量的选择 吸取对照品溶液和供试品溶液各3 μL、5 μL和7 μL，点于同一薄层板上，以正丁醇-冰醋酸-水(4∶1∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以0.2%茚三酮无水乙醇溶液，在105 ℃加热至斑点显色清晰，立即检视，如图4所示。结果显示：对照品溶液和供试品溶液点样量在3～7 μL范围内，各斑点清晰，且分离度较好，故选择点样量为均为5 μL。

2.4 耐用性考察

2.4.1 不同厂牌薄层板的考察 吸取对照品溶液和供试品溶液各5 μL，分别点于三个不同厂家生产的硅胶G薄层板上，以正丁醇-冰醋酸-水(4∶1∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以0.2%茚三酮乙醇溶液，在105 ℃加热至斑点显色清晰，立即检视，如图5所示。结果显示：三种硅胶G薄层板分离效果良好，表明该色谱条件耐用性良好。

2.4.2 不同温度考察 吸取对照品溶液和供试品溶液各5 μL，点于同一硅胶G薄层板上，以正丁醇-冰醋酸-水(4∶1∶1)为展开剂，分别于4 ℃、20 ℃、35 ℃展开，取出，晾干，喷以0.2%茚三酮无水乙醇溶液，在105 ℃加热至斑点颜色清晰，立即检视，如图6所示。结果显示：20 ℃和35 ℃，供试品薄层色谱分离效果良好，但在4 ℃主斑点与杂质斑点未完全分离，分离效果稍差一些，表明在20～35 ℃范围内，温度对薄层色谱鉴别影响较小。

A B C左：对照品溶液，右：供试品溶液A.青岛海洋；B.安徽良臣；C.德国默克图5 不同厂家硅胶板考察结果

A B C左：对照品溶液；右：供试品溶液A.4 ℃；B.20 ℃；C.35 ℃图6 不同温度考察结果

2.4.3 不同相对湿度考察 在双侧展开缸的一侧分别加入适当浓度的硫酸溶液，得到相对湿度分别为RH42%、RH65%、RH88%的环境[1]。取供试品溶液和对照品溶液各5 μL，点于同一薄层板，放在另一侧槽中，密闭放置30 min左右，以正丁醇-冰醋酸-水(4∶1∶1)展开，取出，晾干，以2 g/L茚三酮无水乙醇溶液显色，在105 ℃下加热至斑点清晰，置日光下检视，如图7所示。结果显示：湿度对蒜氨酸对照品与供试品的分离度并未产生影响。

A B C左：对照品溶液；右：供试品溶液A.RH 42%；B.RH 65%；C.RH 88% 图7 湿度对分离度影响

2.5 不同批次大蒜粉的薄层鉴别 按上述实验确定的色谱条件，对来自不同产地大蒜加工的六批次大蒜粉进行薄层鉴别，如图8所示，结果显示：在与对照品相对应的位置，供试品显示相同颜色斑点，不同产地大蒜制得的大蒜粉色谱图一致。

从左到右依次为：蒜氨酸对照品；大蒜粉Y201811001；大蒜粉Y201901021；大蒜粉Y201904003；大蒜粉Y201811004；大蒜粉Y201811005；大蒜粉Y201811006图8 点样量考察结果

3 讨论

本研究参照美国药典、英国药典、欧盟药典及相关文献，建立大蒜粉薄层鉴别方法，确定以蒜氨酸为对照品，以甲醇为提取溶剂制备供试品溶液，点样量5 μL，正丁醇-冰醋酸-水(4∶1∶1)为展开系统，以2 g/L茚三酮无水乙醇溶液为显色剂，105 ℃下加热至斑点清晰，置日光下检视。与美国药典、英国药典及欧盟药典大蒜粉薄层鉴别方法相比，新建方法具有以下几点优势：①英国药典和欧盟药典以丙氨酸替代蒜氨酸做标准物质，而本研究方法以功效成分蒜氨酸标准物质为对照品，专属性更强，达到准确鉴别供试品的目的；②新建方法中供试品制备方法参照欧盟药典，操作简便快速，而美国药典及文献方法中供试品制备方法复杂，提取时长达3 h，不能满足薄层色谱鉴别快速和简便的要求；③展开剂配制方法最简单，且色谱斑点分离效果比欧盟药典的方法好。

本研究中的大蒜粉为来自不同产地的大蒜经切碎、真空冷冻干燥等工艺加工制得，对多批次大蒜粉进行薄层鉴别(仅列出6批薄层鉴别图谱)，结果显示各批次供试品色谱图在与对照品相应位置，显相同颜色斑点，且各批次样品的色谱图具有较高相似度，揭示大蒜粉生产工艺稳定，且不同产地大蒜中氨基酸的组成差异不大。

4 结论

本研究建立的薄层色谱鉴别方法具有操作简单、专属性强、重现性好等优点，为控制大蒜粉的生产工艺、产品质量提供简便易行的检测手段，确保以大蒜粉为原料的保健食品和药品质量可控。