汉防己甲素通过促进HIF-1α降解增强p53缺陷型非小细胞肺癌的放疗敏感性

金磊 郭洁 刘昊 康云帆 吴翔

肺癌是全球发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）是最常见的肺癌组织学亚型［1-2］。放疗由于其对NSCLC显著疗效而被广泛使用，尤其是在肿瘤多发而无法切除的患者中［3-4］。但放疗抵抗是限制放疗的主要因素。已有多项研究报道放疗抵抗潜在的发生发展机制，据报道缺氧与放疗抵抗有关，而缺氧诱导因子-1（hypoxia inducible factor-1，HIF-1）在与缺氧有关的放疗抵抗中发挥主要作用［5-6］。汉防己甲素（tetrandrine，TET）是从防己科植物粉防己（stephamiatetrandra S.Moore）块根中提取的一种双苄基异喹啉类生物碱，具有消炎、抗自由基损伤、抗肝纤维化和抗肿瘤等多种药理作用，临床用于早期轻度高血压、风湿痛、肝癌、晚期肺癌、膀胱癌以及白血病的治疗［7］。近年来，研究发现TET 对NSCLC 具有放疗增敏作用［8］，然而具体机制尚不清晰。

1 材料与方法

1.1 细胞培养和试剂

人NSCLC细胞系H1299（p53-null），Calu-1（p53-null）和H460（wild-type p53）购自中国科学院细胞库。H1299 和Calu-1 细胞系在RPMI 1640 培养基（美国HyClone）中培养，H460 在DMEM 培养基（美国HyClone）中培养，均添加10%胎牛血清（FBS，美国HyClone）和100 g/mL 链霉素和100 U/mL 青霉素（美国Gibco）。对于常氧培养，细胞培养于5%CO2，37℃的培养箱中。对于缺氧培养，细胞培养于1%O2，94%N2 和5%CO2的37℃培养箱中。所有细胞系均不含支原体。TET（中国阿拉丁生化科技有限公司），蛋白质合成抑制剂环己酰亚胺（cycloheximide，CHX，美国Sigma）和蛋白酶体抑制剂MG132（美国Sigma）溶解在DMSO中。

抗体：anti-HIF-1α（1:1 000，Protein Tech Group，中国），anti-ubiquitin（1:1 000，Cell Signaling Technology，美国），anti-γ-H2AX（phosphoS139，1:1 000，Abcam，英国），anti-IκBα（1:1 000，Cell Signaling Technology，美国），anti-phospho-IκBα（Ser32/36，1:1 000，Cell Signaling Technology，美国）及anti-β-actin（1:1 000，Protein Tech Group，中国）。

1.2 方法

1.2.1 放疗 用X射线辐射器（SHINVA，中国）对细胞进行不同剂量（0～8 Gy）的辐射，剂量率为0.189 Gy/min。

1.2.2 细胞活力测定 TET（0～60 μM）预处理细胞（6 h）。对于缺氧暴露，在TET 给药后4 h，将细胞移入缺氧状态持续2 h，然后进行辐射。辐射后，将含TET 的培养基替换为普通培养基，辐射后72 h 通过CCK-8法评估细胞活力。每孔加入200 μL CCK-8溶液，并在37℃下孵育1 h后，使用酶标仪（美国MolecularDevice）测定450 nm 处的吸光度。使用Graphpad Prism 7.0软件计算IC50。

1.2.3 克隆形成实验 将细胞以200～5 000个细胞/皿的密度接种到35 mm 培养皿中，贴壁后将细胞用TET 进行预处理（6 h），其后进行辐射。对于缺氧暴露，在TET给药后4 h，将细胞移入缺氧状态持续2 h，然后进行辐射。辐射后，将含TET的培养基替换为普通培养基，并将细胞维持在常氧条件下。8～12 天后，洗涤细胞，用1%结晶紫染色，并计数包含50个细胞的细胞群体。接种效率（PE）=平均细胞群体数/接种的细胞数。存活分数（SF）=实验组克隆数/（接种细胞数×PE）。用Origin 8.0软件构建存活曲线。生存曲线参数平均致死剂量（D0）和准阈剂量（Dq）通过将数据与单击多目标模型拟合计算。

1.2.4 Western Blot和免疫沉淀 RIPA裂解液提取细胞蛋白，并用BCA试剂盒测定蛋白浓度。用6%～12%的SDS-PAGE分离蛋白，并转移至PVDF膜上。将膜在5%脱脂奶粉中封闭1 h，一抗孵育过夜（4℃）。用TBST缓冲液充分洗涤后，将其与辐射Dye偶联的二抗（1:10 000，美国Li-COR Biosciences）在室温下孵育1 h 后，用Odyssey CLx红外线捕获免疫反应带的图像。

为了进行免疫沉淀（immunoprecipitation，IP），将anti-HIF-1α（英国Abcam）与4 mg细胞裂解液共同孵育，然后用蛋白A/G琼脂糖捕获。充分洗涤磁珠，然后将其悬浮在SDS上样器中以进行蛋白质印迹分析。

1.2.5 RT-PCR RT-PCR 用One Step SYBR®Prime Script TMRT-PCR试剂盒（中国Takara Bio）在Roche480轻型循环仪（Roche）上进行。用于PCR扩增的引物如下：HIF-1α 上游5'-GAACGTCGAAAAGAAAAGTCTC G-3'，下游：5'-CCTTATCAAGATGCGAACTCACA-3'；VEGF上游：5'-AG GGCAGAATCATCACGAAGT-3'，下游5'-AGGGTCTCGATT GGATGGCA-3'；ACTB上游：5'-CTGGGACGACATGGAGAAAA-3'，下游：5'-AAGGAAG GCTGGAAGAGTGC-3'。通过2-ΔΔCt公式计算基因表达相对变化，将ACTB作为内参。

1.2.6 小干扰RNA 转染 使用Lipofectamine 2000 Transfection Reagent（美国Invitrogen），根据说明书使用负性RNA序列（siNC）或HIF-1α小干扰RNA（siHIF-1α，中国Gene Pharma）对细胞进行转染。siHIF-1α的靶序列如下：siHIF-1α-1，GGGTAAAGAACAAAACACA；siHIF-1α-2，AACTAACTGGACACAGTGTGT。siNC和siHIF-1α转染48 h后，将细胞用于进一步实验。

1.2.7 逆转录病毒感染 通过将人全长TP53 cDNA（NM_000017.11）亚克隆到pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro 慢病毒质粒中来构建p53 过表达质粒。如前所述，通过将HEK293T 细胞与p53 过表达的质粒和包装质粒（psPAX2 和pMD2.G）共转染制备慢病毒。用慢病毒感染H1299 细胞，并且从感染后48 h 开始，用嘌呤霉素（2 μg/mL）选择表达p53的稳定细胞系。

1.3 统计学分析

采用SPSS 22.0 软件进行统计学分析，所有实验至少进行3次。数据表示为x±s表示，使用t检验对差异进行评估。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 TET抑制NSCLC细胞生长

将H1299 和Calu-1 细胞以不同浓度的TET 处理6 h 后检测细胞活力，以评估TET 对NSCLC 的杀伤作用。以5、10 μM TET处理6 h的H1299和Calu-1细胞的细胞活力仍高于90%，提示TET在浓度＜20 μM下的细胞毒性较弱。当用较高浓度的TET（≥20 μM）处理细胞后，观察到细胞活力被显著抑制。TET对H1299和Calu-1细胞的IC50分别为27.97 μM和33.83 μM，提示TET以剂量依赖性方式发挥细胞杀伤作用（图1）。

图1 TET对H1299和Calu-1细胞的毒性，**P＜0.01

2.2 在常氧和缺氧条件下，TET 均会增加NSCLC 的放疗敏感性

在有（无）TET处理的细胞中进行辐射，然后通过CCK-8 测定H1299 和Calu-1 细胞的细胞活力，以确定TET 是否可以增加NSCLC 的放疗敏感性。H1299细胞的相对细胞活力在20 μM的TET处理下进行4 Gy的辐射后降至27.65%±1.80%，显著低于仅辐射处理（69.80%±4.84%，P=0.003）或仅TET 处理（47.32%±6.01%，P=0.007）。Calu-1细胞的相对细胞活力也显示出相似的趋势。8 Gy 的辐射照射后也观察到相似结果（图2A）。进一步进行克隆形成实验以测试TET在H1299 和Calu-1 细胞中的放疗增敏效率（图2B）。暴露于相同的辐射剂量（2～6 Gy）后，TET 预处理的H1299 和Calu-1 细胞的相关细胞活力显著低于各自的对照（未进行TET 处理）。TET 处理后NSCLC 放疗敏感性显著增加（表1）。

进一步研究缺氧条件下TET是否在NSCLC中发挥放疗增敏作用。在缺氧条件下进行4 Gy辐射后，H1299细胞的相对细胞活力降至83.07%±5.85%，高于常氧条件下的相对细胞活力69.80%±4.84%，Calu-1细胞的相对细胞活力减少至84.86%±9.27%（图2C），同样高于常氧条件73.56%±6.14%。结果提示TET可增强H1299和Calu-1细胞在缺氧和常氧下的放疗敏感性。克隆形成实验进一步证实缺氧下TET对NSCLC的放疗增敏作用（图2D）。在缺氧状态下进行TET 处理后，增敏比（sensitization enhancement ratio for Dq，SERDq）在H1299中增加至2.59，在Calu-1中增加至1.82（表2）。

2.3 TET 抑制NSCLC 中辐射和缺氧诱导的HIF-1α表达

在辐射6 h 后，H1299 和Calu-1 细胞中HIF-1α的表达升高，辐射剂量增加（＞4 Gy）并未诱导HIF-1α表达进一步增高（图3A）。但在H1299和Calu-1细胞中进行TET（20 μM）预处理后再进行4 Gy 辐射可有效抑制辐射诱导的HIF-1α表达（图3B）。此外，RTPCR 结果提示，辐射后HIF-1α 下游靶标VEGF 的水平显著升高，但可被TET预处理抑制（图3C）。

缺氧条件下H1299 和Calu-1 细胞中HIF-1α 表达增加，在缺氧2 h左右达到峰值（图3D）。在缺氧培养前，使用TET预处理H1299和Calu-1细胞4 h，以评估TET 对缺氧诱导的细胞中HIF-1α 表达的影响。TET 预处理可显著抑制缺氧诱导的H1299 和Calu-1细胞中HIF-1α表达（图3E），同时缺氧诱导细胞中的VEGF mRNA表达也显著降低（图3F）。

通过细胞活性检测评估敲除HIF-1α 后TET 对H1299的放疗增敏作用，以进一步证实TET通过诱导HIF-1α表达降低发挥放疗增敏作用。HIF-1α siRNA转染细胞后HIF-1α 表达显著下调（图3G）。细胞活力分析表明，TET 预处理不会增加敲除HIF-1α 的H1299细胞对辐射的敏感性（图3H～I）。

2.4 TET促进HIF-1α降解

TET 处理后，H1299 和Calu-1 细胞中的HIF-1α蛋白水平均呈剂量依赖性降低（图4A）。TET（20 μM）处理后，通过RT-PCR检测HIF-1α mRNA表达，以验证HIF-1α 蛋白表达降低是否是由于HIF-1α 基因转录受抑制。然而，在有无TET 处理的条件下，H1299和Calu-1 细胞中均未发现HIF-1α mRNA 表达的变化（图4B），提示TET导致的HIF-1α蛋白表达降低并不是通过抑制转录实现。考虑到蛋白质降解也可能导致HIF-1α 蛋白表达降低，通过检测CHX 追踪的HIF-1α蛋白质在有无TET预处理的H1299和Calu-1细胞中的转换率。CHX（100 μg/mL）用于阻断细胞总蛋白合成，并分别于第2、5、10 min 进行追踪，发现TET预处理细胞中HIF-1α蛋白含量的下降速度比未进行TET 处理的细胞中更快，提示TET 加速HIF-1α蛋白的降解（图4C）。由于HIF-1α 蛋白主要通过泛素-蛋白酶体途径降解，因此通过免疫沉淀实验检测蛋白酶体抑制剂（MG132）处理后的H1299 和Calu-1细胞中HIF-1α蛋白的水平。MG132（20 μM）对蛋白酶体的抑制导致多泛素化的HIF-1α的形成，与未经TET处理的细胞相比，经TET处理的H1299和Calu-1细胞存在更多的多泛素化HIF-1α（图4D）。

图2 TET增强H1299和Calu-1细胞的放疗敏感性

表1 常氧下MCL 预处理辐射后H1299 和Calu-1 细胞的存活曲线参数

表2 缺氧下MCL 预处理辐射后H1299 和Calu-1 细胞的存活曲线参数

图3 TET抑制辐射和缺氧诱导的HIF-1α表达

图4 TET促进H1299和Calu-1细胞中的HIF-1α蛋白降解

2.5 p53降低TET的放疗增敏作用

在常氧和缺氧条件下，经TET处理的H460的相对细胞活力在暴露于相同剂量的辐射（2～6 Gy）后略低于对照细胞，SERDq在常氧下增加至1.07，在缺氧下增加至1.21，明显低于p53 野生型的H1299 和Calu-1 细胞（表3，图5A，B）。在H460细胞中进行TET处理后，未观察到HIF-1α蛋白水平显著降低（图5C）。此外，进一步评估TET对H460细胞中辐射或缺氧诱导细胞中的HIF-1α表达的抑制能力。在H460细胞中，辐射仅诱导HIF-1α的轻微表达，并且在辐射后使用TET（20 μM）无法阻断HIF-1α的表达（图5D）。尽管缺氧可诱导H460细胞中HIF-1α的表达，但TET处理并未影响HIF-1α的表达（图5E）。此外，在H460细胞中进行辐射或缺氧处理后，TET也不影响VEGF mRNA的表达（图5F）。

设计稳定表达p53（P53）以及对照载体（VC），并转染H1299 细胞进行克隆形成实验，以进一步证实p53 对TET 的放疗增敏作用具有拮抗作用。在常氧和缺氧条件下，与对照组（单独照射）相比，辐射在VC H1299 细胞中，辐射显著降低了经TET 处理的细胞的相对细胞活力，但在p53 H1299 细胞中却没有（图5G，H）。在常氧和缺氧条件下，TET 处理的VC H1299 细胞中SERDq 分别增至1.89 和2.10，而P53 H1299细胞中SERDq分别为1.04和1.30，提示TET的放疗增敏作用被p53显著抑制（表4）。TET预处理可有效抑制对照和VC H1299 细胞中的辐射和缺氧诱导的HIF-1α表达，但p53 H1299细胞中HIF-1α表达不受TET影响（图5I，J）。

表3 常氧和缺氧条件下经TET 预处理的H460 细胞辐射后的存活曲线参数

图5 p53通过抑制HIF-1α蛋白降低来减弱TET的放疗增敏作用

表4 常氧和缺氧条件下经TET预处理的辐射VC和p53 H1299细胞辐射后的存活曲线参数

3 讨论

HIF-1α 是放疗敏感性的关键因素［9-10］。由于辐射和缺氧诱导HIF-1α 活性增加，抑制HIF-1α 表达被认为是降低肿瘤放疗抵抗的合理策略［11-13］。本研究中，辐射或缺氧暴露后，H1299 和Calu-1 细胞中HIF-1α 表达均显著升高。在缺氧条件下，H1299 和Calu-1 细胞中较高的放疗抵抗性证实了HIF-1α 在放疗抵抗中的关键作用。同时，本研究结果表明，TET 处理可抑制H1299 和Calu-1 细胞中辐射和缺氧诱导的HIF-1α 表达。敲低HIF-1α 明显减弱了TET对H1299 细胞的放疗增敏作用，证实HIF-1α 是TET放疗增敏的关键靶标。此外，TET还抑制了辐射和缺氧诱导的VEGF mRNA表达，提示其对HIF-1α/VEGF途径的抑制。VEGF 是HIF-1α 的靶基因之一，在暴露于辐射或缺氧后表达增加，抑制VEGF 或VEGFR是改善临床肿瘤放疗敏感性的有效策略［14-16］。因此，本研究推测抑制HIF-1α/VEGF途径可能是TET的潜在放疗增敏机制。这一推测也得到了另一项研究的支持，该研究利用NVP-BEZ235 或UO126 抑制HIF1-/VEGF途径导致子宫内膜癌细胞的放疗增敏［17］。

蛋白表达可在转录和蛋白水平上被调节，本研究发现TET 不会影响HIF-1α mRNA 的表达，但会降低HIF-1α 蛋白表达水平，提示TET 在蛋白水平上调节HIF-1α 的表达。HIF-1α 在蛋白水平上的调节是通过调节蛋白质合成和降解来实现。据报道，磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）或有丝分裂原活化的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）途径的激活参与了HIF-1α 的合成［18-19］。HIF-1α 的降解主要通过泛素-蛋白酶体系统调控。此外，CHX 追踪分析的结果表明，TET 通过促进HIF-1α 蛋白的降解速率而降低HIF-1α 蛋白的稳定性。进一步研究表明，在存在TET 的情况下，HIF-1α的泛素化水平比在MG132处理后不存在TET的情况下高。同时，TET 诱导的HIF-1α 泛素化也提示TET 可影响泛素-蛋白酶体途径中HIF-1α的稳定性。最近研究报道表明，HIF-1α 的降解被组蛋白脱乙酰基酶（histone deacetylase，HDAC）抑制，尤其是HDAC1 和HDAC3，其可与HIF-1α 的氧依赖性降解域（oxygen-dependent degradation domain，ODDD）结合。此外，HDAC1 调节泛素连接酶（E3）蛋白复合物von Hippel-Lindau 蛋白（pVHL）的还原，该复合物介导HIF-1α的降解。因此，TET可能通过下调HDAC1来加速HIF-1α 的泛素化和蛋白酶体降解过程。此外，本研究发现在野生型p53细胞中未观察到TET的放疗增敏作用，TET处理未能抑制野生型p53野生型无作用细胞中辐射和缺氧诱导的HIF-1α 蛋白和VEGF mRNA的表达。考虑到p53在调节TET放疗敏感性中的重要作用，应在使用TET作为放疗增敏剂之前检测NSCLC患者的p53状况。

综上所述，TET通过抑制HIF-1α表达及其下游靶点VEGF增强p53缺陷型的NSCLC细胞的放疗敏感性。TET可通过促进泛素依赖性HIF-1α蛋白降解来抑制HIF-1α表达。但是，p53的存在可通过拮抗TET介导的HIF-1α降低来减弱TET的放疗增敏作用。