基于显微视觉的酶联斑点图像识别计数

熊国顺，张从鹏，谢佳成，解毅， 张堉 晨

（北方工业大学机械与材料工程学院，北京100144）

0 引 言

结核杆菌T细胞酶联斑点（T-Spot）检测具有灵敏度高、特异度高的优点，是临床结核病诊断的重要手段[1]。目前，对酶联斑点的计数主要依靠人工方法，对临床医生的专业水平要求高，同时存在效率低、劳动强度大等不足。近年来，Corkidi G等[2]利用微生物菌落表面的光学特性，采用多级阈值方法实现对粘连及大小不均菌落的分离和计数；周萤莉等[3]提出用Otsu算法结合Hough变换提取目标区域，用距离变换和分水岭算法分割菌落，对分割后的菌落筛选计数；司秀娟等[4]设计了基于Android平台的菌落计数系统。张立新等[5]提出一种基于改进水平集的全自动菌落分割、计数方法。国内外学者对在斑点自动识别计数方面取得了一定的研究成果[6-7]，但对T-Spot显微图像的自动计数研究较少，本文以开发细胞酶联斑点自动检测仪为目标，研究酶联斑点自动识别计数技术，具有重要理论与现实意义。

1 系统描述

T-Spot显微视觉平台由运动控制系统和计算机显微视觉系统组成[8]。实现对T-Spot的逐孔扫描采集和图像处理，如图1所示。选用500万像素的UM012C型数码显微镜，放大倍率为300倍；T-Spot标板选用标准的96孔酶标板。

2 目标区域提取

2.1 自动阈值分割

由于环形光源和标板小孔视野中心很难重合，存在非均匀照明现象，造成目标区域轮廓的图像灰度不一致，无法通过单一阈值对图像进行分割，如图2(a)所示。本文采用自动阈值分割方法[9]，分割流程图如图3所示：通过判断原图像和参考图像对应点的像素差值是否大于局部阈值，来分割目标区域和背景区域。通过自动阈值算法分割效果如图2 (b)所示。

图1 显微视觉平台

图2 分割对比图

图3 自动阈值分割流程图

通过自动阈值分割，可以得到目标区域的大致轮廓，排除大部分背景像素干扰，为进一步边缘轮廓提取打下基础。

2.2 边缘轮廓提取

如图2(b)所示，粗分割后的图像具有丰富的边缘轮廓信息及边缘干扰信息；酶标板单孔内边界为图像的真实边界，由于光照不均造成的投影边界、附着在边界的斑点及杂质等均为干扰信息。边缘轮廓提取的目的是排除干扰因素，获取目标区域真实边界，实现精确分割。首先对分割后的图像进行连通域划分，根据酶标板单孔面积及圆度特征初步提取出边缘轮廓，如图4(a)所示。

2.2.1 边缘轮廓筛选

对边缘轮廓进行筛选之前需要对“粗”轮廓边缘进行光滑处理。通过对平滑算法的研究及实验验证，采用基于形态学的闭运算来平滑边界区域[10]。通过闭运算光滑处理后区域边缘轮廓线变得光滑，适合对边缘轮廓进行筛选。对边缘轮廓区域重新划分连通域，观察发现，新的连通域由圆弧和局部自封闭轮廓组成，通过限制矩形度选出所有的圆弧区域，筛选后的轮廓图如4(b)所示。

2.2.2 边缘拟合

针对常规最小二乘法拟合圆对于离群值鲁棒性较差的问题，引入权重来减小离群值带来的影响[11]。权值大小与轮廓点到拟合圆的距离成反比。

拟合圆的处理流程为：首轮计算时对参与计算的每个轮廓点赋予相同的权重，拟合出圆；计算轮廓点到拟合圆的距离，根据权重函数赋予每个点对应的权值，拟合出更精确的圆；这样，根据上一次拟合结果计算轮廓点到拟合圆的距离，通过权重函数赋予每个点新的权重，多次迭代可以得到理想的拟合结果[12]。拟合结果如图5(a)所示，通过对拟合结果添加半径约束得到最终拟合结果。

经过边缘拟合得到目标区域的精确边缘轮廓，根据拟合结果的圆心坐标及半径信息可以从原图中准确分割出目标区域。

图4 边缘提取

3 识别计数

图5 拟合结果

3.1 基于距离变换的分水岭分割

分割后的目标区域如图5(b)所示，部分斑点存在明显的粘连现象，本文选用基于距离变换的分水岭算法[13]对斑点图像进行处理。算法分割流程如图6所示。

3.2 计数

通过分水岭算法分割目标，通常会存在过分割现象，在实际应用中需要对算法进行优化[14]。本文通过对距离变换前的图像进行形态学处理，消除噪声、锯齿边缘等干扰因素；对于分水岭分割后的区域选取合适的面积阈值，过滤由伪局部极小值点造成的过分割区域。经验证，该方法能够有效提高分割精度，抑制过分割现象，优化后的分割效果图如图7(b)所示；对经过筛选后的区域进行连通域划分，通过计算连通域个数即可得到斑点个数。

4 实验

通过如图1所示显微视觉平台对标准的96孔酶标板进行图像采集，共采集图像384幅，分为128组，每组包含阳性对照孔、阴性对照孔、抗原孔图片。利用本文设计的图像处理程序对斑点进行计数，根据酶标板厂家提供的标准对结果判读。

判读标准为[15]：若阴性对照孔斑点数为0～5，抗原孔斑点数减去阴性对照孔斑点数大于等于6，结果判定为阳性，小于6为阴性；若阴性对照孔斑点数大于等于6，抗原孔斑点数大于等于2倍阴性对照孔点数，结果判定为阳性，否则为阴性。实验统计结果如表1所示。

实验结果显示：结核病检验测试的灵敏度为96.19%, 特异度为91.30%，假阳性率为3.81%，假阴性率为8.70%，综合准确率为95.31%。对比美国FDA临床研究数据[16]，T-SPOT.TB用于结核病的诊断特异度为97.1%，灵敏度为95.6%；本文算法在灵敏度方面与国外研究持平。

对于仪器检验结果，临床医生仅需对照放大图像进行复核，即可出具诊断报告，从而大大降低了医生的劳动强度，提高了检验效率。

图6 识别计数流程图

图7 斑点识别计数

表1 本文算法实验结果

5 结 论

本文针对酶联斑点人工计数存在的问题，设计了一套基于图像处理的酶联斑点自动识别计数算法；通过自动阈值和精确拟合方法，实现了复杂背景下的目标区域图像的准确提取；对目标区域中粘连斑点实现有效分割，减少了过分割现象。实验结果表明：采用本文算法对酶联斑点自动识别计数并进行结果判读，在阳性样本识别方面表现良好，综合准确率达到95.31%，可作为辅助医师临床检验的有效工具。